DNA izolasyonu, genetik çalışmalar yapacağımız zamanlarda gerçekleştirdiğimiz deneylerden yalnızca biridir. Yöntemin prensibi; hücre zarının ve varsa hücre duvarının lizis çözeltiler ile parçalanmasını, açığa çıkan organellerin ve diğer bileşiklerin, tuzlu suda çöktürülmesi ile DNA’nın ortamdan alınıp farklı bir tüpte stoklanması esasına dayanır.
DNA İzolasyon Protokolü
DNA izolasyonu için kullanılacak kimyasallara öncelikle sahip olmamız gerekir. Ancak bu kimyasalların pek çok alternatifi vardır. Genel olarak izolasyonda; lizis buffer, doygun tuzlu çözelti ve etanole ihtiyacımız vardır.
DNA İzolasyonu İçin Gerekenler
- Lizis solüsyonu
– 0.5 M Tris-HCl pH 8.0,
– 20 mM EDTA
– 10 mM NaCl
– 1% SDS
– 0.5 mg/mL proteinase K - Doygun NaCl (6M)
- Etanol (%96, %70)
DNA İzolasyon Deneyi
- DNA izolasyonu için öncelikle hücre zarının (varsa hücre duvarının), organellerin, proteinlerin parçalanması gerekir. Bunun için lizis solüsyonları kullanılır. Lizis için; proteinaz, RNAz, tuz (NaCl), deterjan (tween 80 gibi) içeren çözeltiler hazırlanabilir.
- Lizis çözelti eklendikten sonra, etkisini göstermesi için 30 dakika – 1 saat kadar beklenebilir. Ancak ortama lizis buffer ile beraber EDTA (DNAz’ı inhibe etmesi için) eklenir.
- 1 mL doygun NaCl eklenir. Böylece, santrifüj sonrasında DNA tuzlu suda kalırken katı birimler pellet kısmında kalır.
- Tüp 10 bin rpm’de 5 dk santrifüj yapılır.
- Santrifüj sonrasında, süpernatant kısım alınır ve farklı bir tüpe aktarılır.
- Yeni tüpte tuzlu çözelti içerisindeki DNA alkol ile yıkanır.
- Tüp 10 bin rpm’de 5 dk santrifüj yapılır.
- DNA pellet kısıma geçtiği için süpernatant pipet ile alınır ve atılır. Ardından tekrar alkol eklenir ve santrifüj yapılır. Bu adım bir kaç kez tekrarlanır.
- En sonda alkol içerisinde kalan DNA’dan son kez alkol çekilir ve atılır. Kalan alkolün uçması beklenir ve üzerine distile su eklenir.
- DNA saf su içerisinde +4 derecede saklanır.
DNA manuel izole edilebileceği gibi otomatik olarak cihazlar yardımı ile de izole edilebilir. Bunun için gelişmiş DNA izolasyon cihazları vardır. DNA izolasyon cihazlarına örnek olarak aşağıdaki ürünleri gösterebiliriz.
