FISH Yöntemi Nedir ve Nasıl Yapılır?

In Situ Hibridizasyon

In situ melezleme istenilen mRNA içeriğinin doku içerisinde nerede bulunduğunu anlamamıza-görmemize yarayan tekniktir. Bu yöntem inceleyenin ilgilendiği mRNA’nın normal yerini görmesine olanak sağlamaktadır.

In situ melezleme oldukça kolay ve kullanışlı bir teknik olduğundan oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Histolojik dokulardaki hedef mRNA’nın işaretlenmiş nükleik asit probuna hibridizasyonunu sağlayarak dengeli hibritler oluşturur ve böylece probun yeri görülebilir.

Bu teknoloji ayrı türlerdeki hücre popülasyonlarında gen anlatımı çalışmak için kesin bir metottur. Çünkü tek bir hücre çözünürlüğünde hedef mRNA’nın bulunmasını mümkün kılmaktadır.

Kullanılan prob tipleri:

DNA probları: Yüksek spesifik aktivite gösterir. Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir.

RNA probları: RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir. RNA probları düsük stabilite gösterir ve RNaz’larla kolaylıkla yok edilebilirler.

Oligonükleotid probları (15-50 nükleotid): Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak tasarlanır. Problar çok stabildir. Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.

Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH)

Floresan in situ hibridizasyon çoklu, sayı, yapı ve mikrodelesyon gibi kromozom anomalilerini saptamak için yaygın olarak kullanılan bir metottur.

Olumlu Yönleri

• Sonuca hızlı ulaşılır.
• Bütün doku tiplerine uygulanabilir (kan, ilik vb.) Standart sitogenetik metodlarla saptanamayan delesyonları saptar.

Olumsuz yönleri:

• Standart G-bantlama calışmalarının yerine geçemez fakat yanında kullanılabilir.
• Tüm kromozom için iyi olmasına rağmen sadece birkaç kromozomal segmentle sınırlıdır.

Yöntem

Yöntem oldukça basittir. Amaç floresan özelliği taşıyan ve ilgili DNA kısmına spesifik olan moleküllerin, ilgili oldukları kısma bağlanması, bağlanmayan moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması sağlanır. Böylece hibridizasyon olduğunda ilgili böylenin tespiti yapılmış olur. Florasan özellik taşıyan bu moleküllere prob, meydana gelen bu olaya ise hibridizasyon denir.

Hibridizasyon işleminin ardından, DNA ve prob kompleksi UV ışık altında incelenir ve ışımaya bakılır. Işıma varsa, prob bağlanmış (istenilen bölge var), ışıma yok ise prob bağlanmamış (istenilen bölge yok) demektir.

A) Tanısal amaçlı kullanılan FISH

1. Klinik sitogenetik
a. Prenatal tanı
b. İnterfaz sitogenetiği
c. Mikrodelesyon sendromlarının tanısı
d. Kanser sitogenetiği
2. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısı
3. Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin değerlendirilmesi

B) Araştırma amaçlı FISH

1. Gen haritalaması
2. Tümör biyolojisi
3. Mikrobiyoloji/viroloji
4. Gen ekspresyon analizi
5. Somatik hücre hibrit analizleri
6. Mayoz/mitoz analizleri
7. Hücre tanımlaması

İlk aşama çift iplikli kromozom DNA’sını ve prob DNA’sını denatüre etmektir. Böylece prob ve kromozom DNA’sı birbirine bağlanabilirler. Bu işlem DNA’nın yüksek sıcaklıkta ısınmasıyla gerçekleşir. Ardından ortama prob eklenerek probların DNA’ya bağlanması sağlanır. Ardından UV ışık altında incelenir.