Vücudumuzun temel yapı taşı olan proteinler 22 aminoasitten oluşur, bu sayede hücreler ve kişiler arasındaki çeşitliliği sağlar. Hücrenin hayatta kalabilmesi için sahip olduğu DNA bilgisini protein ürününe dönüştürmesi gerekmektedir. Hücre sayımız fazla olduğu için binlerce protein ortaya çıkar. Sayısı fazla olan proteinlerin her yapısının analiz edilmesi gerekir. Yani proteinin tanımlanması için gereken analiz peptid kütle parmak izi (PMF) dir. Proteinler aslında polipeptiddir, bu büyük ve karmaşık yapıyı analiz etmek için küçük olanından yani peptidden başlayabiliriz. Peki peptid nedir? Peptid: Aminoasitlerin birbirleriyle bağlanması sonucu oluşan kısa polimerdir. Protein ve peptid arasındaki temel fark, proteinin daha uzun olmasıdır.
Peptid Kütle Parmak İzi Nedir?
Alman ve Japon bilim adamlarının bir araştırma ekibi kurarak 1980’lerin sonlarına doğru buldukları analiz tekniğidir. Yaygın kullanımı 1933’ten sonra başlamıştır, hızlı, hassas ve güvenilirdir. Son yıllarda tanımlanan proteinlerin çoğu bu yöntem kullanılarak tespit edilmiştir. PMF’de protein tanımlanmasında şu an genellikle kullanılan iki yaklaşım var:
- Bottom-up
- Top-dawn
Bottom up:
Protein tanımlanmasının ilk adımı da denebilir. Sindirilmiş proteinlerle peptid analizi yapılmak istendiğinde bu yaklaşım kullanılır. Protein sindirilmesi için iki yaklaşım var: Proteolitik enzimlerin yer aldığı enzimatik sindirimler, diğeri ise kimyasal kullanılarak gerçekleştirilen enzimatik olmayan sindirimlerdir. Bottom-up yaklaşımı kapsamlı protein tanımlanması için bir temel sunar. Birkaç basamak işlemle proteinden peptid seviyesine ulaşılır. Burada peptidlerden yola çıkılarak protein bilgisine veri tabanları aracılığı ile ulaşılır.
Top-dawn
Burada proteinin direkt olarak kendisinden yola çıkılarak analiz yapılır. Bir başka deyişle sindirilmemiş proteinlerle peptid analizi yapılır.
Biyoinformatik Açıdan PMF Analizi
Bu analizde referans alacağımız yani veri ağından yararlanacağımız araç Matrix Science veri tabanıdır. Matrix Science: Kütle spektrometresi verilerini kullanarak proteinlerin tanımlanması yapar. Aşağıdaki kırmızı ok ile işaretlenen yere tıklanarak veri tabanına ulaşılır.
Aşağıdaki kırmızı ok ile gösterilmiş yere tıklanır.
Kırmızı ok ile gösterilen bölge PMF analizi için sunucuya erişimi sağlar.
Peptid kütle parmak izi için kırmızı ok ile işaretli yere tıklanınca asıl analizin yapılacağı portala bağlanır.
- Birinci kutucuk, veri kaynağı, sekans bilgilerini hangi kaynaktan alınacağını belirtir. Swiss Protu seçmemizin nedeni daha düzenli ve gözden geçirilmiş bir veri tabanı olmasıdır.
- İkinci kutucukta ise enzyme kısmına deneyde kesim için hangi enzimi kullandıysak o enzim işaretlenir. Biz deneyde Tripsin proteazı kullandık, onu işaretledik. Allow up to ise Tripsin enziminin kesemediği kaç parçanın göz ardı edileceğini sormaktadır. Biz bunu bir olarak aldık, eğerki hiç göz ardı edilmesin derseniz sıfır işaretlenmelidir.
- Üçüncü kısmında ise Taxonomy’i belirlemek, yapacağımız çalışmanın daha da sınırlandırılmasını sağlar. Bu deneyden elde edilen triptik peptid ağırlıkları hangi organizma olduğu bilinmediği durumlarda tüm organizmalar (All entries) seçilir. Eğer ki bilinirse hangi organizma olduğu buradan işaretlenir.
- Kırmızı okla gösterilen Fixed modifications, kesin olduğunu bildiğimiz modifikasyon varsa sağdaki kısımdan işaretlenir. Fixed modifications, aminoasit modifikasyonlarının işaretlenmesine olanak sağlar. Yani bir protein çalışmasında kullanılan bir kimyasalın o proteinin/ peptid üzerindeki etkisi bilinmektedir. Veri tabanı bu bilgileri kullanarak analiz yapar. Yaptığımız deneyde, sistein aminoasitlerinin disülfit bağı yapmasını engellemek için ”iodoacetamide” yöntemini kullanılırız. Bu da C-carbomidomthyl kullanılır, yani sisteinleri kapatıp disülfit bağını engeller. Carbomidomthyl(C), sistein aminoasidi için geçerlidir. Parantez içinde hangi harf varsa o aminoasidi temsil eder ve ona spesifik olarak yapılmış demektir.
- Kırmızı okla gösterilen Variable modifications deneyde, kesin olarak kullanıldığını bilmediğimiz kimyasallar işaretlenir. Kimyasal olabilir de olmayabilir de bunu triptik peptidlerin kütlesinde hata vermemesi için işaretleriz. Yani analizin daha spesifik olması için bizim yaptığımız deneyde emin olmadığımız bir kimyasal yok, o yüzden bu seçeneği boş bırakıyoruz.
- Üçüncü kısımda peptide tol, örnek peptid ağırlıklarının kesin olarak rapor edilmesinde kütle spektrometresinin kapasitesinin bir ölçütüdür. Genellikle bu değer 1 olarak girilir. Protein mass (protein kütlesi) bu da genel bir kütle bilgisidir, 500 kDa olarak girilir. Mass values (iyon yükü) +1 olarak gireriz. Monoisotopic ise o molekülün olabilecek en hafif ağırlığa sahip olan halini alırız. Average ise ortalama kütleyi alır. Biz bu analizde monoisotopic olarak işaretledik, analize göre değiştirilebilir.
- Dördüncü kısımda, kütle spektrometresi ölçümünden sonra elde edilen triptik peptidlerin kütleleri ile oluşan havuzundan alınan kütleleri gireriz. Dikkat edilmesi gereken kütle bilgilerinin girdisinin yapılabilmesi için Query seçeneğine tıklanmalıdır.
- Veri tabanının ilk 20 sonucu göstermesini istediğimiz için Repoit top 20 girdik. Ardından tüm kütleler girildikten sonra search yapılır.
Kırmızı okla gösterilen Protein score, bize score değerinde 70’den yukarısının anlamlı veri olduğunu söyler. Ayrıca top score da hangi organizmaya ait olduğunu gösterir. Homo Sapience olduğunu veri tabanı söylemektedir.
Buradaki önem verdiğimiz parametreler:
Score değeri: Burada 70’den yukarı score değerini aldığımız için en uygunu bize ilk sıradaki kırmızı ile işaretlenen 123 score değeridir.
Matches değeri: Bu değer ne kadar yüksekse o kadar geniş spektrumda protein eldesi olacağını ifade etmektedir. Bizim 10 tane çıkmış, yani bu şu demektir: 10 tane peptidden bile anlamlı bir protein eldesi yapabiliriz.
Expect değeri: Triptik peptidlerin oluşturduğu proteinlerin spesifikliğini verir. Değer ne kadar düşükse triptik peptidlerin başka bir proteinle eşleşme oranı o kadar düşüktür. İkinci bir proteinle eşleşmesi çok zordur. Sayısal değerin sıfırdan küçük olması her zaman daha iyi sonuçlar verir.
Son olarak triptik peptid kütlelerinin ait olduğu protein Apolipoprotein olduğu anlaşılmıştır.
Apolipoprotein: Lipitleri kan akımıyla taşıyan lipoprotein komplekslerinin protein bileşenleridir. Yapısal bütünlük sağlayıp hidrofobik lipitleri merkezinde saklar.
