Illumina HiSeq 2500 Cihazı Nasıl Çalışır?

Aynur Atan 31 Mayıs 2020

0 3 dakika okuma süresi

Biyolojik fonksiyonların entegre analiz sistemi geliştikçe bu sistemler için komplike yüksek verimlilik veren cihazların geliştirilmesi gerekiyordu. Bu cihazlarda ana hedef olarak yüksek çalışma hızı ve yüksek çalışma modları esas alınmıştır. Çok çeşitli uygulamaları ve çalışma boyutlarını destekleyen, esnek ayrıca ölçeklenebilir bir platform sağlar. Birçok çalışma alanına sahiptir cihazlar. Örnek verecek olursak genom sekanslama, ekzom sekanslama gibi zor karmaşık işleri hızlı bir şekilde yapar. Aslında cihazı temel olarak ele alırsak yüksek verimlilik sağlayan bir sekanslama sistemidir. Genom merkezlerinde sekanslamaya dayalı işlemler çok fazla olduğu için cihazı bu araştırma merkezleri daha fazla kullanmaktadır. Bu sistemi geliştiren şirketlerin temel hedefleri, varyasyon ve fonksiyon analizleri için yeni teknolojiler üretmektir.

Illumina HiSeq 2500 Nedir?

Dizi teknolojileri ve yenilikçi sıralama ve moleküler tanılamada da kullanılmaya başlandı. Cihaz, genetik hastalıkların tespitine yönelik çalışmalar için kullanılıyor. Nadir hastalıkların tanısında da kullanılıyor. Cihaz, kimyasal sentezleme temelli yeni nesil DNA dizileme sistemini cihaz kullanıyor. Cihaz, tüm genom dizileme, ekzom dizileme, hedefli dizileme, bütün transkiptom RNA seq gibi yüksek verimli işlemler için tasarlanmış illumina dizileme cihazıdır. Çalışma başına 1 Tb veri kapasitesine sahiptir. Sistem ayrıca yapılandıralabilme özelliğine sahiptir. Yani cihaz, aynı anda 1 veya 2 akış hücresi taşıyacak şekilde yapılandırabilir. 300 milyon ile 4 milyar okuma gibi geniş bir yelpaze sunar. Cihaz, yüksek çıkış modunda 27 saat sıralanırken 30x kapasama alanında 8’e kadar insan genom verisini işleyebilir. Cihaz bünyesinde dokunmatik bir ekran arayüzene bulunmaktadır. Adım adım yönderilmiş iş akışlarını yapan bir yazılıma sahiptir. İstatistikleri gerçek zamanlı olarak cihazdan veya dışarıdaki bir bilgisayardan kontrol edebilir. İyi kurulmuş bir sekans kullanır yani floresan şeklinde işaretlenmiş nükleotid bazların DNA şablon ipliklerine dahil edilirken tespit edildiği sentez (SBS) yöntemi ile bunu sağlar. Ham hata oranını azaltmak için dört tersinir terminatöre bağlı dNTP’lerin her biri her sekanslama döngüsünde kullanılır. Ayrıca bu yöntem kullanıldığı için birleşme yanlılığı en aza indirilir. Bu yüzden cihaz oldukça verimli analizler yapar. Ayrıca illumina başka sekans cihazlarına da sahiptir: www.bilimvetekno.com/illumina-miseq-cihazi-nasil-calisir

Illumina HiSeq 2500 Nasıl Kullanılır?

Kimyasal sentezleme temelli yeni nesil DNA dizileme yöntemi kullanan bu cihaz için ilk önce dizileme kütüphaneleri oluşturulur. Kütüphaneyi oluşturmak için Illumina HiSeq 2500 ile uyumlu TruSeq Nano DNA Low Throughput Library Prep Kit kullanılır (Kit yapılan çalışmaya göre değişiklik gösterebilir.). SBS, sequencing by synthesis HiSeq Rapid SBS Kit kullanılarak iki fragmanın uç uca birleştirilmesi ile elde edilen tek fragman okumaları şeklinde gerçekleştirilir.Yöntem genellikle üç ana aşamadan oluşur:

Kütüphane oluşturma
Sekans reaksiyonu ve yürütme
Veri Analizi

Kütüphane Oluşturma:

Dizileme kütüphaneleri oluşturmak için cihaz ile uyumlu kitler kullanılır. Örnek verecek olursak TruSeq Nano DNA Low Throughput Library Prep bu kit cihaz ile uyumludur. Kitteki protokole göre adım adım işlemler gerçekleştirilir.

Fragmantasyon ile Adaptör Uyumlu DNA’ların Hatırlanması

TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit ile uyumlu Covaris Inc cihazı yardımıyla fragmantasyon işlemi mekanik olarak yapılmıştır. İşlem sonucunda 3′ ucu ve 5′ ucunda çıkıntı olan dsDNA elde edilmiştir. Ayrılmış olan DNA‘ların pürifikasyonu kitin içerisinde bulunan manyetik pürifikasyon boncukları kullanılarak yapılmıştır.

Kırık DNA Uçlarının Tamiri Ve Kütüphane Boyutu Seçimi:

Elde edilen DNA fragmanlarının kırık uçları, kitin kendi içinde End Repair Mix 2 ile değişim geçirerek kör uçlara çevrilmiştir. Tamir işlemi reaksiyonu sonucunda 3′ ucundan 5′ ucuna ekzonükleaz aktivitesi ve 5′ uçtan 3′ uca polimeraz aktivitesi ile DNA fragmanlarının her kısmı bu yöntemle tamir edilmiştir. Kitin bünyesinde olan SPB ile fazla uzun ve fazla kısa DNA fragmanları elenerek 350 bp büyüklüğündeki kütüphane oluşturmak için seçilmiştir.

Uçların Adenilasyonu:

Kit içeriğindeki ATL RSB reajenleri kullanılarak kör uçlu DNA fragmanları kör uçlu DNA fragmanlarının her birinin 3′ uçlarına ‘A’ nükleotidi eklenmiştir. Adapter ligasyonu aşamasından fragmanların kendi arasında birbirine bağlanması engellenir.

Adaptörlerin Ligasyonu:

Ligation Mix 2 kullanılarak DNA fragmanlarının uçlarına barkod adaptörler eklenmiştir. Barkod adaptörler eklenmiştir. Adapterler aracılığıyla fragmanlar Flow Cellin bağlanmakta ve ayrıca barkod bölgesi birbirinden ayırt edilmesi sağlanmaktadır. SPB manyetik pürifikasyon boncukları ile adaptör eklemiş, DNA parçaları eklenmemiş olanlardan ayrılmasını sağlar.

DNA Fragmanlarının Zenginleştirilmesi ve Kütüphane Validasyonu Kalite Kontrolü:

Sekanslamada verimli sonuçlar alabilmek için kit içeriğinde bulunan PCR Primer Kokteyl Miksi kullanılarak PCR yöntemi ile adaptör eklenmiş DNA fragmanlarının zenginleştirilmesi bu sayede yapılır. Kütüphanenin kantitasyonu için qPCR yöntemi kullanılır.

Kütüphane Normalizasyonu:

Buradaki temel amaç havuz oluşturmaktır. Kit içerisindeki DCT plakalar kullanılarak DNA kütüphanesi ayarlanacak ve PBD plakalarında eşit hacimde bir araya getirilip bir havuz oluşturulması amaçlanmıştır.

Sekans Reaksiyonu ve Yürütme

Cihaza uygun tasarlanmış kit kullanılarak sekanslama işlemi gerçekleştirilir.Cihazın tam verimli çalışması için kitin cihaza uygun olması gerekir .

Veri Analizi

Yapılan işlemlerden sonra çıkan bilgiler yani genom bilgisi, fasta formatında çıkmıştır. Bu fasta formatı kalite kontrol aşamasından geçirilmelidir. Bakılması gerekenler baz düzeyinde sekans kalitesi, sekans düzeyinde kalite değerlerinin dağılımı, baz ve sekans düzeyinde ‘GC’ okunamayan sekans içeriği, sekans uzunluk dağılımı, sekans tekrar düzeyidir. Bunlara bakılıp hızlı bir kontrol yapılacaktır. Biyoinformatik araçlar ile hatalı sekanslar tespit edilecek analizin doğruluğu arttıralacakdır.