Hücre analiz yöntemleri son yıllarda oldukça gelişme kaydetti. Bunlardan biri de özellikle ayrıntılı bir analiz imkanı sunan akan hücre ölçer (Flow sitometri) cihazı oldu. Cihaz klinik tanı ve tedavide çok önemli bir veri ağı sunar. Hücrelerin fenotip ve karakteristlik özelliklerini kalitatif ve kantitatif olarak inceler. Saha çalışmalarında kullanımıyla birlikte insan sağlığını olumsuz etkileyen klinik enfeksiyonun tespiti ve tedavisinde hızlı bir analiz yöntemi sundu. Temel yaklaşımı hücrelerin boyutu, şekil, DNA ve RNA içeriği, sitoplazmik granüleritesi açısından incelenir.1870’li yıllarına kadar çalışma prensibi eski olsa da 1969 yılında argon lazer kullanımı ile daha da gelişmeye başladı. 1980 yılında ayırma işleminin bulunması, analiz yönteminde üst düzey analiz imkanı sağlamıştır. Firmalar, yoğun çalışmalarla son on yılda cihazı geliştirerek günümüzdeki halini almasını sağladı.
Flow Sitometri Nedir?
Flow sitometri, çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde akış kanalı boyunca tek tek geçmesi ve hücre büyüklüğüne göre sınıflandırılmasına dayanan bir analiz yöntemidir. Sitometri, hücrelerin veya biyopartiküllerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinin ölçülmesidir. Bir akış noktasındaki parçacıkların bir algılama noktasının diğer tarafına geçerken fiziksel ve kimyasal karakterlerini belirlemenin bir yoludur. Geliştirilen akış sitometrisi, bir ışık kaynağı, toplama optiği ve dedektörleri ve sinyalleri verilere dönüştüren bir bilgisayardan oluşur.Bir akış sitometrisi ışık kaynağının genellikle bir lazer tarafından üretilen oldukça spesifik bir dalga boyuna sahip büyük, güçlü bir fluorosen mikroskobu olduğu söylenebilir. Hücre lazer ışını içinden geçerken ışık her yöne saçılır, hücre yüzeyinde bulunan florokrom heyecanlanır ve yüksek dalga boyunda ışık yayar. Yayılan ışık iki lens tarafından toplanır. Işın ayracı, optik filtre dedektör belirli florokromlara özgü ışığın dalga boylarını izole edebilir. Altı taneye kadar florokrom ölçülebilir. İlk başlarda hematoloji laboratuvarlarında kullanılsa da daha sonradan immünoloji, onkoloji gibi farklı bilim dallarında kullanılmaya başlandı.
Flow Sitometrinin Temel Bileşenleri
Cihazda, sıvı sistemi, ışık kaynağı, filtreler, sinyal dedektörleri, yazılım programları, cell sorting (ayırma mekanizması) bileşenlerinden oluşmaktadır. Temelde üç bileşenden oluşur:
Hidrolik Bileşen
Partiküllerin lazer önünden geçişi için taşıyıcı sistem görevini yürütür.
Optik Bileşen
Lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan fluorosen saçılımının çapraz ve silindirik filtrelerde toplanarak düzgün bir şekilde fotodetektöre aktarılmasını sağlar.
Elektronik Bileşen
Optik sinyalin PMT ile amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevrilerek analiz için bilgisayara aktarılmasını sağlar. Sistem bir merkezi kanaldan oluşur, alınan örnek buradan cihaza aktarılır. Laminar akıntı ve çevreleyen sıvı birbirine karışmadan bir yol alır. Biyopartiküller sıra halinde dizilir ve hidrodinamik olarak isim alır. Bu sayede lazer ışını tek hücreye düşer, spesifik bir tek hücre analizi yapar. Işın öne doğru yayılır, lazer ile aynı yöne düşer ve bu sayede partiküllerin iç yapısı hakkında bilgi verir.
Flow Sitometri Nasıl Çalışır?
Hücre lazer ağının içinde ilerlerken saptırılan lazer ışığı ve hücreler tarafından yayınlanan fluorosen ışığı bir araya getirilip optik filtreler ile aynalar farklı dalga boylarına ayrılarak analog sinyallere dönüştürülür. Sinyaller dijital ortamda şekillendirilir ve ölçülen parametrelerin frekans dağılımlarının görsel olarak bilgisayara yansıtılmasıdır. Ayrıca ölçüm sırasında hücreler canlı, sabit olmalıdır.Ölçümün daha iyi olabilmesi için dizi şeklinde askıda olması gerekmektedir. Bir nevi uyarıldıkları için fluorosen ışığı yayarlar.
Cihaz, hücreler içinde aynı zaman diliminde birden fazla parametreye bakar:
- Hücre çapı
- Hücre içindeki granül yapı
- Fluorosen yoğunluğu
Fluorosen yoğunluğu hücreler için eş zamanlı olarak ölçülür. Hücrelerin bileşenlerini rapor etmek için fluorosen problar kullanılır.
Temelde flow sitometri cihazında üç grafik öne çıkar:
- Forward scatter (ileri saçılma grafiği), hücrenin yaklaşık büyüklüğü hakkında bilgi verir.
- Side scatter (yana saçılma grafiği) granülitesi hakkında bilgi verir.
- Fluorosen grafiği yani belli dalga boyuna sahip parıldama eldesi hakkında bilgi verir.
Flow Sitometri Nasıl Kullanılır?
Hücre Belirlenmesi
Analiz edilen hacimler çok küçüktür. Hazırlık basamakları:
- Santrifüj
- Teğetsel akış filtrasyonu
- Polikarbonat zar filtreleri
- Nükleopor
Kalibrasyon
Araçların kalibrasyonu, kaçan hücrelerin doğrulanması açısından oldukça önemlidir. Analiz edilecek örneklerin hücre konsantrasyonunun kalibre edilmesi gerekir.
Partiküllerin Optik Özelliklerinin Belirlenmesi
Hücre boyutu hakkında bilgi sahibi olmak için ileri ışık saçılmaları kullanılır. Fluorosen ile boyanın içeriği belirlenir. İstenilen her bir bilgi için hücre sinyallere bölünerek popülasyonlar için normalize edilir. Logaritmik amplifikatör kullanılırsa normalizasyon yapılmadan önce lineerleştirilir.
Cell Sorting
Agar plaklar üzerinde direkt gruplanma bir avantajdır. Bakteri, maya gibi benzeri türler için hücre gruplama stratejileri olması gerekmektedir. Hücre gruplayıcılar:
- Droplet deflection
- Mekanik gruplayıcılar
Örnek Hazırlanışı
Tuzlu çözelti içinde serbestçe asılı duran hücre tipleri analiz edilir. Farklı teknikler de kullanılabilir.
Etiketleme
Hücreler fluorosen yayan boyalarla etiketlenir. Kimyasal boyalar yüzeydeki hücre moleküllerine tutunur.
Tek Dizi Akışı
Kimyasal boyalarla etiketlenen dizi, dar bir boruda akıtılarak tek sıra halini almaya zorlanır.
Lazer Aydınlatması
Etiketlenen hücreler optik olarak uyarılır. Fluorosen ışıma yapması bir molekülün akış hızına odaklanan ışığın büyüklüğüne bağlıdır.
Fluorosenların Toplanması
Yayılan ışınlar pek çok alandatoplanır. Lazer ışınları filtre edilir.
Veri Analizi
Dedektörler ve sinyal oluşturan ekipmanlar oldukça önemlidir. Spesifik analiz bu ekipmanların kalitesine bağlıdır.
Flow Sitometrinin Kullanım Alanları
- İmmünfenotipleme
- Hücre döngüsünün incelenmesi
- Hücre canlılık analizi
- Mikrobiyoloji
- Hematoloji
- İlaç alım ölçümleri
- Su ürünleri
