BilimGenelMakaleler

Real Time PCR Cihazı Çalışma Prensibi

Günümüzde genetik ve genetiğe dayalı çalışmaların gelişmesi ile elde bulunan PCR(Polymerase Chain Reaction) cihazının geliştirilmesi gerekiyordu, bunun sonucunda eş zamanlı analiz yapan bir cihaza ihtiyaç duyuldu. Bu ihtiyaçları karşılamak için Real time PCR (RT-PCR) cihazını geliştirdiler. Klinik laboratuvarlarda ve rutin uygulamalarda kullanılan ve oldukça kolaylık sağlayamaya başladı. Gen anlatım çalışmalarının hızına bir ivme kazandırdı. Geliştirilen cihazın avantajlarından biri de çok az miktardaki biyolojik örnek ile hızlı, güvenli, hassas  bir analiz yapma olanağı sunmasıdır. Bu şekilde hızlı sonuçlar verdiği için son beş yılda hızlı bir şekilde kullanımı artmıştır. Şu an pandemi (salgın) için de oldukça kilit rol oynuyor, koronavirüs RNA’sını tespit eden RT-PCR ile doğrulanıyor, sonuçlar 1-3 saat arasında çıkıyor.

Real Time PCR Nedir?

Kısa sürede  kantitatif (nicel) analiz  sonucu  verebilen PCR yöntemidir. Gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek eş zamanlı olarak reaksiyonun gidişine müdahale etmeyi olanak sağlar. Sıcaklık döngüleri ve floresan analizi aynı tüp ve aynı cihaz içinde yapılır. Elektroforeze gerek kalmadan çoğalma esnasında sonuç alınabilmektedir. Reaksiyon boyunca artan ürün miktarı ile doğru orantılı olarak floresan ışıma, bilgisayar ekranına pikler şeklinde yansıtılır.  Spesifik amplifikasyon (çoğaltma) sonrasında elde edilen ürün varlığının saptanması en kolay yöntemi ”SYBR Green I” dir. Ardından erime eğrisi (melting curve) analizi yapılarak hedef bölgenin amplifikasyonumu yoksa non-spesifik ürün olduğunu tespit edilir. Floresan okuma tekniğini kulladığı için yabancı kaynaklarda, Floresan kantitatif RT-PCR  olarak da adlandırılabilir. Ticari olarak kullanılan  cihazların arasındaki temel farklılıklar uyarılma seviyeleri, emisyon ve reaksiyon kapasitelerinin farklı oluşundan kaynaklanmaktadır.

Günümüzde piyasada en yaygın kullanılan Real time PCR cihazları aşağıdaki gibidir:

  • LightCyler (Roche)
  • TagMan (PE Biosystem)
  • iCyler (BIO-RAD)
  • Rotor-Gene Q
  • Thermo Fisher Scientific PCR

Real Time PCR Cihazı Nasıl Çalışır?

Real time PCR’ da  termal döngü cihazıyla birleştirilmiş optik okuma sistemi bulunmaktadır.İşlem sırasında ampfilikasyonu (çoğaltmak) monitörün ekranına yansıtacak bir prob (işaretleyici) gerekmektedir. Prob kullanılarak Real time PCR cihazının monitöründe görüntüleme yapılır. Prob, florofor ve belirlenen  dalga boyundaki ışıklarla uyarıldığında floresan ışıma yapabilen oligonükleotidlerdir. Hazırlanan tüp içerisinde kopyalama işlemi gerçekleşirken çoğaltılmış olan seçilen DNA zincirlerine bağlanılarak  çoğaltılan ürün miktarına parelel olarak  cihazın bünyesinde bulundurduğu optik okuma sistemi  sayesinde floresan ışıma yapılmış olur. Hedef DNA üzerinde prob komplementer (tamamlayıcı) olduğu bölgeye bağlandıktan sonra cihazın ışık kaynağı devreye girer. Tüp içerisine kısa dalga boylu uyarıcı ışık gönderilir,  ışığın emiliminden sonra uzun dalga boylu ışık salınımı gerçekleşir. Cihaz prob sayesinde floresan  ışımayı algılar. Prob ile DNA miktarı doğru orantılı olmalıdır çünkü tüp içerisinde bulunan hedef DNA’ ya ne kadar prob bağlanırsa bağlanma miktarına paralel olarak floresan ışıma miktarı o kadar fazla olur. Çoğaltılmış hedef dizilerin görüntülenme yapılabilmesi için farklı problar mevcuttur.

Floresan kimyasına bağlı yöntemler ikiye ayrılır:

  • Genel yöntemler
  • Zincire özgü yöntemler

Genel yöntemler, PCR tüpü içerisinde her çift zincirli DNA‘ ya bağlanan prob floresan ışıma oluşmasına neden olur. Zincire özgü yöntemler bu yöntemin spesifik özgüllüğü daha yüksektir, primer bağlanma bölgeleri arasındaki seçilen DNA’nın tamamlayıcı (komplementer) bölgesine bağlanarak floresan ışıma yapar. Spesifik özgül olma nedeni protein-dimer bağlanmasında ışıma yapmamasıdır.

Real Time PCR’da önemli prob sistemleri ve özel boyalar:

1.Özgül olmayan floresan boyalar

  • SBYR Green I
  • Etidyum Bromid

2.Özgül floresan işaretli problar

  • FRET
  • Moleculer Beacon
  • Tag Man
  • Scorpion Primerleri
  • Hibridizasyon Probları

Özgül olmayan floresan işaretli problar:

DNA’ya özgül olmadan bağlanan özel boyalar prob görevi görür , en sık kullanılanı ”SYBR Green I” dir. Çift zincirli DNA’ya bağlanan SYBR Green I boyasıdır. Çift zincirli DNA’nın arasına girerek floresan ışıma yapar, bu ışıma Real Time PCR cihazındaki optik sistem tarafından algılanır. Ortamda hedef DNA bulunmadığı zaman primer -dimer bağlanması görülür. Bu yapının oluşması özgüllük açısından istenmez. Erime eğrisi analizi yapılır, her çift sarmal DNA’nın kendine özgü erime sıcaklığı vardır. PCR  amplifikasyonu  sonrasında sıcaklık yavaş yavaş yükseltilerek belirli zaman dilimlerinde tüpün içerisindeki floresan ışıma miktarı yazılır. Çift zincirli DNA iplikleri birbirinden ayrılmaya başlayınca boya (SYBR Green I)  serbest kalıyor ve floresan ışıma miktarı azalıyor. Erime eğrisinden yaralanılarak erime sıcaklıkları hesaplanır. Klinik örnek ile pozitif kontrol karşılaştırılır, eğerki erime sıcaklıkları aynı ise o zaman hedef bölgenin amplifikasyonu olduğuna karar verilir. Farklı ise  amplifikasyonun özgül olmayan ürüne  ait olduğu ortaya çıkar.

Özgül floresan işaretli problar:

Çoğaltma işlemi gerçekleştirilmiş olan ürünün tamamına değil de spesifik olan bölgesine bağlanır. Buradaki amaç seçilen bölge içindeki proba tamamlayıcı dizinin varlığını göstermektir.

FREET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Spesifik problardan 3′ ucundan  floresan boya ile işaretli diğeri 5′ ucundan alıcıya boya ile işaretlidir. Bağlanma sonrasında 5′ ucundan sentez olmaması için bu uca fosfat bağlanmıştır. Problar, spesifik bölge üzerinden 1-5 nükleotid uzaklıkta yani birbirine yakın yerlere bağlanır. Boyanın ikisi de yan yana geldikten sonra açığa çıkan enerji ile bu son bağlanan boyayı etkileyerek floresan ışıma oluşumuna olanak sağlar. Ürün miktarı ile floresan  ışıma oluşumu doğru orantılıdır.

Moleculer Beacon

Burada DNA’ya bağlandıktan sonra yapısal değişiklikler meydana geldiği için ışıma olur. Tag Man problarından esinlenerek geliştirilmiştir. 5′ ekzonükleaz aktivitesinde kullanılan problarla benzerlik gösterir. Rapotör ve baskılayıcı moleküllerin komşuluğunda birbirini tamamlayıcı dizileri vardır. Bu yapını tamamlayıcı olduğu DNA’ya tamamen bağlanabilmesi için doğrusal olarak açılması gerekmektedir. Işıma oluşması için baskılayıcı etkinin ortadan kalkması gerekir. İki florokrom birbirinden uzaklaşınca baskılayıcı etki ortadan kalkar ve ışıma meydana gelir. Bunun olabilmesi için sistemde doğrusal bir şekilde bağlanma meydana gelmesi gerekmektedir.

Tag Man

Temelde 5′ ekzonükleaz aktivitesidir, çift etiketli hidroliz problarıdır. Klinik numunelerden  seçilen dizinin miktarını ölçmek için Tag Polimeraz enziminin 5′ ekzonükleaz aktivitesini  kullanılır. 5′ ucuna tutturulmuş bir raportör boya ve 3′ ucuna tutturulmuş baskılayıcı boyaya sahip oligonükleotiddir. PCR sırasında prob, PCR ürününün  iç bölgesine ileri ve geri primer   arasında spesifik olarak tavlar. Polimeraz daha sonra primerin uzatılmasını gerçekleştirir ve Tag Man ‘nın bağlı olduğu şablonu çoğaltır. Döngüde üretilen ürün arttıkça floresan miktarı da paralel olarak artış gösterir. Kilit nokta burada prob DNA’ya bağlandığı için ışıma oluşmaz, ışımayı 5′-3′ ekzonükleaz aktivitesinin probu kırmasıyla ışıma meydana gelir.

Real Time PCR Cihazı Nerelerde Kullanılır?

  • Onkolojik Çalışmalar
  • Patojenlerin Tespiti
  • Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar
  • Doğum Öncesi Tanı Çalışmaları
  • Adli Tıp
  • Gen Anlatımı Çalışmaları
  • Genotipleme
  • Metilasyon Çalışmaları
  • Bio-terorizm
  • İlaç Endüstrisi

Aynur Atan

Nevşehir Hacı Bektaşi Veli Üniversitesi Moleküller Biyoloji Genetik

İlgili Makaleler

5 Yorum

  1. Real Time PCR hakkında gerçekten güzel bir yazı olmuş sizin sayenizde daha güzel bilgiler edindim 🙂

  2. Çok yanlış bilgiler var.. En basitinden
    Günümüzde piyasada genellikle üç tip ticari olarak Real time PCR cihazı kullanılmaktadır. cümlesi..
    Longgene nerede? Yazıyı yazan kişinin üniversitesinde bile bulunan Bioneer markası nerede??? Biraz dikkat!!

    1. Merhaba, öncelikle değerli yorumunuz için teşekkür ederim. Cihazlar kısmında en yaygın kullanılanlara yer verdim. Hatalı olduğunu düşündüğünüz yerler hakkında bilgi verirseniz yardımcı olabiliriz.

    2. Bir şeye yanlış derken doğrusunu söylerseniz daha yararlı olursunuz. Ayrıca doğrusunu bilmediğiniz şeyin yanlış olduğunu kanıtlayamazsınız. Suölama yapmadan önce içeriği dikkatli okumanızı öneririm; “en yaygın kullanılan Real time PCR cihazları” demiş yazar.

  3. Detay ve güzel bir içerik olmuş. Birçok yerde bu kadar detaylı anlatılmamıştı. Genetik denince akla gelen en temel yöntemlerden bir tanesi oysa ki PCR. PCR’ın çalışma prensibi de bence oldukça önemli bir konu. Teşekkürler bilgiler için.

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir

Göz Atın
Kapalı
Kapalı
Kapalı