Patojen tespiti için başvurulan genetik analiz yöntemleri, alınan örneğin türüne ve örnek içerisinde aranan çeşitliliğe göre değişkenli göstermektedir. Örneğin; içeriği bilinmeyen bir numunede 16S/18 veya ITS sekans analizi oldukça uygun bir yöntemken, dizisi bilinen bir veya birkaç patojenin varlığı PCR (Polimerase Chain Reaction) yöntemi ile saptanabilmektedir. Patojen türlerini şu şekilde sıralayabiliriz;
- Bakteriyel patojenler
- Viral patojenler
- Paraziter patojenler
- Toksijenik küfler
1. PCR (Polimerase Chain Reaction) Yöntemi İle Patojen Tespiti
İçeriği tam olarak bilinmeyen ancak bir ya da birkaç farklı patojenin varlığını tespit edilmesi için başvurulan yöntemlerden biri olan PCR, genomu bilinen patojenler için kullanılabilmektedir.
PCR yöntemleri kendi içerisinde farklılık göstermektedir. Örneğin; Real Time PCR ile deney süresince eş zamanlı olarak sonuç alınabilirken, sadece genetik materyalin çoğaltılması ve elektroforez yöntemi ile yürütülerek, patojenin genetik haritasından bir parçanın olup olmadığına bakılabilir. Ancak burada özellikle dikkat edilmesi gereken husus, seçilen bölgenin o patojene spesifik olması gerektiğidir. Bunun için özel primerlerin tasarlanması gerekebilir. Çünkü spesifik olmadığı durumlarda, çoğaltılan bölgenin patojene ait olup olmadığı konusunda kesin bir kanıya varmak doğru olmaz.
Bu yöntemin basamakları genel olarak aşağıdaki gibi sıralanabilir;
- Örnek hazırlama
- PCR’ da genetik materyal çoğaltma
- Tespit (agaroz jelde yürütme) ve görüntüleme
PCR esnasında kalıp olarak kullanılacak genetik materyal genelde DNA’dır. Çünkü DNA, RNA’ya göre daha stabil bir halde ve ortamdan izolasyonu daha kolaydır. PCR öncesinde DNA konsantrasyonunun optimum seviyede olması gerekmektedir. Bunun için gerektiğinde pürfikasyon ya da dilüsyon yapılmalıdır.
2. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
DNA, restriksiyon enzimleri ile spesifik bölgelerden kesilebilmektedir. Bu enzimler DNA’yı keserken küt veya yapışkan uç oluşturabilir. Bu durumda kesilen bölgeye farklı DNA dizisinin bağlanması da sağlanabilir. Örnek vermek gerekirse, rekombinasyon DNA teknolojisi ile plazmid DNA’sında farklı genler aktarılırken bu yönteme sıkça başvurulmaktadır.
Yine patojen tespitinde de restriksiyon enzimlerinden yararlanılabilmektedir. RFLP olarak adlandırılan yöntem, DNA’nın izole edildikten sonra PCR ile çoğaltılmasını ve patojene spesifik restriksiyon enzimleri ile muamele edildikten sonra, jel elektorforezde yürütülerek DNA lader ile karşılaştırılmasını esas almaktadır.
Yöntemde spesifik restriksiyon enziminin patojen DNA’sını kaç BP uzunluktaki fragmanlara ayıracağı bilindiğinden dolayı, jel görüntüsünde ortaya çıkan fragmanlar DNA ladder ile karşılaştırılarak, patojenin varlığı tespit edilebilir.
Şayet restriksüyon enzimi sadece patojene özgü ve o patojenin genetik materyalinin varlığında kesim yapacak cinsten ise, kesim olduğunda patojenin ortamda olduğu sonucuna varılabilmektedir.
3. Koloni Hibridizasyon Yöntemi ile Patojen Tespiti
Koloni hibridizasyon yönteminde genetik materyal olarak DNA kullanılmaktadır. DNA izole edildikten sonra, nitroselüloz veya naylon membran üzerine aktarılır ve işaretli problar ile muamele edilerek hibridizasyonu sağlanır. Ardından mebran üzerinde görüntülenir.
Bu yöntemde problar radyoaktif izotoplar içerebileceğinden genellikle rutin laboratuvar koşullarında kullanılmaktan kaçınılmaktadır. Probların radyoaktif izotop içermediği durumlarda ise sinyal seviyesinin az oluşu, yöntemi bir miktar kullanışsız kılabilmektedir. Buna karşın, koloni hibridizasyon tekniği kültür doğrulama testlerinde pek çok avantaja sahiptir. Örneğin, yüksek sayıda petri kabında oluşturulan kolonilerin, tek mebran yüzeyine aktarılarak aynı anda test edilmesi mümkündür. Ayrıca aynı hibridizasyon çözeltisinin birden fazlı filtrede kullanılabilmesinden kaynaklı olarak maliyet düşüktür. Koloni hibridizasyon yöntemi, birçok bakteri türüne göre farklı biyokimyasal testlerle aynı veya daha iyi seviyede sonuç verebilmektedir.
4. Metagenom Dizileme
Bir numunede hangi mikroorganizmaların nasıl bir yoğunlukta bulunduğunun tespiti için başvurulan yöntemlerden biri metagenomik dizilemedir. Bu başlık altında genellikle 3 parametre bakılabilirken (16S, 18S, ITS) tüm metagenom dizileme ile mikroorganizmanın tüm genomu dizilenebilir. Bu yöntemler genelde biraz daha maliyetli olmaktadır. 16S analizlerinde prokaryot, 18S analizlerinde ökaryot ve ITS analizlerinde mantar bakılabilmektedir.
5. PCR Ribotyping Yöntemi
Aranan mikroorganizmanın hangi suşunun bulunduğunu tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. 16S ve 25S bölgeleri arasındaki korunan bölgeler suşlar arasında farklılık göstermektedir. Genetik materyalin izolasyonu yapılır ve ribotyping yöntemi ile bu bölgeler analiz edilir.
Kaynaklar
- İbrahim Çakır., M Lütfü Çakmakçı., Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi., Gıdalarda Patojen Mikroorganizma Aranmasında Kullanılan Moleküler Genetik Yöntemler., 2005.
- Ali Aydın., Mert Sudağıdan., İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi AD., Gıda Mikrobiyolojisinde Moleküler Biyolojik Tekniklerin Kullanımı ve Tiplendirme Yöntemleri., 2016.
