PCR, yani “Polimeraz Zincir Reaksiyonu” dizisi bilinen herhangi bir organizmaya ait genomik DNA‘daki özgün bölgelerin çoğaltılması esasına dayalı bir tekniktir.
1993’te keşfedilmesine karşın halen günümüzde gen çoğaltmada kullanılan en temel tekniktir. Bugün herhangi bir genetik araştırma yapacak olsanız, işe o genin çoğaltılması ile başlarsınız. Bunun için akla gelen ilk yöntem PCR olacaktır.
Bugün birçok genetik hastalığın sebebini biliyorsak ve hali hazırda genetik mühendisliği bu kadar gelişmiş ve gelişmeye devam ediyorsa, Dünya bunu Kary Mullis‘e borçlu.
PCR’ın Tarihi
DNA polimerazın PCR için önemi tartışılamayacak kadar büyüktür. 1959 yılında Arthur Kornberg ve ekibi tarafından Esherichia Coli’de yer alan DNA Polimeraz I enziminin keşfi, ona Nobel Ödülü‘nü (Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü) kazandırırken aynı zamanda da “Genetik Mühendisliği“nin de parlak geleceğinin aydınlatılmasına katkı sağlamıştı.
Ancak olay bununla sınırlı değil. Günümüzde kalıtım bilimin babası olarak bilinen Gregor Johann Mendel‘in ölümünün 100. yıl dönümünde, yani 1985’te, Cetus firmasının “İnsan Genetiği” departmanında görevli Kary Mullis, Yellow Stone Milli Parkı‘nda “Thermus Aquaticus” bakterisinde sıcağa dayanıklı “Taq Polimeraz” enzimini izole ederek, DNA Polimerazın keşfine anlam katmıştır.
1993 Kimya Nobel Ödülü
1983 yılında Kary Mullis, Cetus firmasında kısa DNA parçaları olarak adlandırdığımız oligonükleotidler üzerinde çalışırken, hücre içerisinde meydana gelen DNA sentezinin aslında in vitro koşullarda da gerçekleştirilebileceğini keşfetti. Ancak reaksiyonda; erime, bağlanma ve sentez sıcaklıklarının çok farklı olduğu da bariz bir şekilde ortadaydı ve 1859 yılında Arthur tarafından keşfedilen DNA polimeraz enzimi, bu sıcaklıklar için uygun değildi.
Kary Mullis, in vitro koşullarda DNA sentezinin gerçekleştirilebilmesinin genetik biliminin önünü açacağının farkındaydı. Bu yüzden yüksek sıcaklıklarda canlılığını sürdürebilen ve DNA sentezi gerçekleştirebilen bakteri arayışına başlamış oldu.
2 yıl kadar süren araştırmanın sonucunda Kary Mullis, Yellow Stone Milli Parkı’nda “Thermus Aquaticus” isimli yüksek sıcaklıkta yaşayabilen ve DNA sentezi gerçekleştirebilen “Thermofilik” bakteriyi buldu ve ondan “DNA Taq Polimeraz” enzimini izole ederek, in vitro koşullarda DNA sentezini gerçekleştirebildiğimiz PCR’ın temelini atmış oldu. Bu araştırmalarda sürekli yanında olan ekip arkadaşı Michael Smith ile birlikte 1993 Kimya Nobel Ödülü‘ne layık görüldü.
PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
PCR, farklı türlerde yüksek miktarlarda rekombinant DNA molekülü oluşturmamız gerektiğinde kullandığımız bir yöntemdir. PCR’ın en büyük amacı, belli bir DNA dizisinden yüksek miktarda elde etmektir.
Peki Neden Çok Fazla Kopyaya İhtiyacımız Var?
Genetik mühendisliğinin en büyük nimetlerinden bir olan transformasyon, yani gen aktarımı için yüksek miktarda DNA ile ve aynı şekilde yüksek miktarda vektör ile çalışıyoruz. Böylece transformasyon başarımız da aynı ölçüde yüksek oluyor. Bunun dışında çalıştığımız genin konsantre olması da onun daha kolay ve daha kapsamlı incelenebilmesi için ölçü teşkil ediyor.
Transformasyon sürecinde tek bir DNA parçasını vektör ile aktarmak yerine milyonlarca kopya şeklinde aktarmak, başarı oranını doğrudan etkiliyor.
Adli tıpta da yaygın olarak kullanılan PCR, aynı zamanda sağlık alanında da birçok genetik hastalığa ışık tutmaktadır. Kişilerin hangi genetik hastalığa yatkın olduğunu anlamamız için başvurduğumuz temel tekniklerden sadece bir tanesidir.
Tespit için tek bir parça kullanmak ve bununla başarılı olmak neredeyse imkansız bir şey. Bu sebepten DNA dizisi ilk olarak amplifikasyona (çoğaltma) tabii tutuluyor. Daha sonra elektroforez ile elektrik akımına maruz bırakılıyor ve büyüklüklerine göre ayrım yapılıyor. Tabii bunun PCR’dan sonra tespit için kullanabileceğimiz onlarca yoldan biri olduğunu da unutmamak gerekiyor.
PCR’ı istediğimiz bölgeye “Zoom” yapmak için kullanıyoruz da diyebiliriz. Binlerce baz çifti uzunluğundaki DNA’yı incelemek yerine, ilgilendiğimiz kısmı incelemek genetik mühendisliğinin zaman ile ilişkisi düşünüldüğünde çok daha mantıklı geliyor.
PCR Malzemeleri ve Görevleri Nelerdir?
- Kalıp olarak kullanılacak DNA
- Çoğaltılacak bölgeye özgü forward ve reverse primerler
- Dört tip deoksiribonükleotit yani dNTP (adenin, timin, guanin, sitozin)
- Yüksek sıcaklıklarda çalışabilen Taq Polimeraz enzimi
- MgCl (Taq Polimerazın kofaktörüdür.)
- Tampon
PCR Tekniği Nasıldır?
Genelde vücut sıvılarından izole ettiğimiz DNA, çift iplik halinde karmaşık bir yapıda bulunmaktadır. PCR ile istediğimiz bölgenin amğlifikasyonu için DNA’yı ilk olarak tek iplik haline getirmeliyiz. Bu olaya “Denatürizasyon” denmekte.
PCR ile in vitro koşullarda denatürizasyounu sıcaklık ile gerçekleştiriyoruz. Bunun için DNA’nın bulunduğu ortamı 96°C’ye kadar ısıtmamız gerekiyor.
Sarmalı oluşturan iki zincir sıcaklık ile birbirinden ayrılacak ve amplifikasyonu gerçekleştireceğimiz bölgeyi belirleyen primerlerimiz, bu ayrılan iki zincire bağlanacaktır. Bu olaya “Annealing” denmekte ve bunun için sıcaklığın 55°C dolaylarına düşürülmesi gerekmektedir.
Annealing protokolü gerçekleştikten sonra, yani primerler DNA ipliklerine hibridize olduktan sonra sıcaklık 72°C dolaylarına çekilir ve uzama olarak nitelendirdiğimiz “Extension” basamağı başlar. Bu olayın tekrarı arttıkça çoğalan DNA’nın saflığı ve miktarı artar.
Tekrar sayısı isteğe bağlıdır ve duruma göre değişkenlik gösterebilirken genelde 30-35 tekrar uygun görülmektedir. Buna ek olarak tekrar sayısının artması, Taq Polimeraz enziminin kalitesini olumsuz etkileyeceği unutulmamalıdır.
