Genetik Tanı Yöntemleri Nelerdir?

Genetik Tanı Yöntemleri

Aileden geçen kalıtsal bir hastalık olup olmadığını anlamak için genetik tanı merkezlerinde yapılan genetik testler sonucunda genetik hastalıkların tanısı erken dönemde konulabilir. Genetik testlerinin tümünün tanısı için doğum öncesi (prenatal) ve doğum sonrası (postnatal) genetik testleri uygulanır. Doğum öncesi genetik testler: Anne karnındaki fetüste görülebilecek genetik hastalığın teşhisi için amniyon sıvısı, koryon villus kordon kanı ya da anne kanındaki fetüs DNA’sında genetik tarama testleri yapılır. Anne ya da babada genetik bir hastalık var ise preimplantasyon genetik teşhis embriyo seçimi ile sağlıklı embriyo transferi sağlanabilir. Embriyolara yapılan genetik tanı (PGT) testi ile en sağlıklı embriyo seçilebilir.

Sitogenetik Tanı Yöntemleri

Sitogenetik, genetik materyali hücresel düzeyde inceleyen bilim dalıdır. Kromozomların işlev ve morfolojileri mitotik, mayotik metafaz sürecinde değerlendirilir. Amaç, kromozomlar halinde paketlenmiş DNA’da meydana gelen yapısal, sayısal değişiklikleri ve köken farklılıklarını (kimerizm, mozaisizm,) saptamak, elde edilen sonuçla fenotip ile genotip arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir.

Sitogenetik Bandlama Yöntemi

Kromozomal yapısına gelmiş olan DNA metafaz da iken hücre döngüsü kimyasal ajanlar yardımıyla durdurulur ve kromozomlar elde edilir. Çeşitli boyalar kullanılarak yapılan farklı bandlama yöntemleri ile kromozomlar değerlendirilir. Karyotipleme için en çok kullanılan Giemsa bandlama (G bandlama) yöntemidir. Enine açık ve koyu bandlar elde edilir. G bandlama ile 400-700 arasında band değerlendirilir ve genom taranarak 10Mb boyutundaki değişiklikler tespit edilir. Diğer sık kullanılan bandlama teknikleri: Floresans bandlama, Reverse bandlama, C-bandlama, NOR bandlama yöntemleridir. Klasik bandlama yöntemleri oldukça basit ve uygulamada fiyatı uygun yöntemlerdir. Bu nedenle, in situ hibridizasyon yöntemleri uygulanmadan önce modern sitogenetik analizlerin temel çalışması olarak uygulanırlar.

Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH)

FISH genomda istenilen hedef DNA bölgesinin floresan veren DNA probları ile boyanarak in situ olarak gözlenmesine imkan tanıyan moleküler sitogenetik bir yöntemdir. Yöntemin temelinde, hedeflenen DNA bölgesine komplementer florokromlarla ,floresans veren moleküller, işaretlenmiş olan tek iplikçikli DNA dizileri kullanılır. Bu florokromlarla işaretli DNA dizilerine prob adı verilmektedir. Bu yöntemde ilk basamak FISH yönteminin uygulanacağı kromozomları veya interfaz hücrelerini elde etmektir. Hedef kromozom ya da kromozom bölgesine ve amaca bağlı olarak kullanılan çeşitli problar vardır.

Problar

Tüm Kromozom Boyama Probları: Kromozom ya da kromozom kollarının tanımlanması için kullanılan problardır.

Sentromer Spesifik Problar: Sentromer yakınındaki alfa satellit bölgesine özgü problardır.

Lokus Spesifik Problar: Delesyon ya da duplikasyonları, füzyon genleri tespit etmek ve gen lokalizasyonunu belirlemek için kullanılan belli bir gen bölgesine özgü problardır. Tümör genetiğinde sıklıkla kullanılırlar.

Telomerik Problar: Kromozomların terminal bölgelerini tanımlayan problardır. Hücre yaşlanması, kromozomal yeniden düzenlenmeler ve delesyonların araştırılmasında kullanılır. Her kromozoma özgü telomerik prob bulunmaktadır.

Spektral Karyotipleme

Teknik her biri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla hazırlanmış 24 farklı kromozom boyama probu ile 24 kromozomun eş zamanlı hibridizasyonu ve tek bir filtreye sahip floresans mikroskobu ile analizine dayanır. Otuz bir farklı hedefi ayırt edebilmek mümkündür. Işınım emisyonlarının ölçülmesi hibridizasyonun değerlendirilmesine olanak sağlar. Kromozomlar kendine ait farklı karakteristik bir dalga boyunda veya floresansta izlenir.

Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon

Bu teknikte esas amaç DNA kopya sayısındaki artışı veya eksilmeleri ortaya koymaktı. Yöntem, iki farklı florokrom ile işaretlenmiş kontrol ve test DNA’larının anomali içermeyen normal metafaz plağı üzerinde hibridize edilmesi esasına dayanır. Bu iki florokromun yoğunluğunun oranı sağlıklı hücre ile değerlendirilen hücrenin kopya sayısı farklılıklarını gösterir. Genomdaki dengesiz materyalin daha ayrıntılı ve doğru analizi ve özellikle dengeli görünen bir genomda yer alan belirgin olmayan sapmaları göstermek için kullanılır. Ayrıca gen amplifikasyonu bakımından tümör genomunun taranması ve amplifikasyonun kromozomal lokalizasyonunun saptanması amacıyla da kullanılır. Bu yöntem ile hasta DNA’sındaki kromozomal kayıp veya belli bir bölgenin amplifikasyonu gösterilir.

Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri

Restriksiyon enzimlerinin kullanılmaya başlanması ile moleküler tanı yöntemleri de gelişmeye başlamıştır. Günümüzde klinikte konulan hastalık tanıları, moleküler tanı ile desteklenmektedir. Ayrıca, ilaç etkinliğinde genotip fenotip ilişkisi giderek önem kazanmakta ve kullanılan ilaçlardan en az zararla, en etkin şekilde yararlanma olanakları araştırılmaktadır.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Hücre içinde doğal olarak gerçekleşen DNA replikasyonunun tüp içinde kopyalanmak istenilen bir bölgenin çok fazla sayıda çoğaltılmasını sağlayan bir yöntemdir. Çok az miktardaki örnekten spesifik bir gen bölgesini çoğaltmak, tanıya yönelik incelemeler ve araştırma yapmak için yeterli genetik materyal sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. İlgili DNA bölgesi PCR ile çoğaltıldıktan sonra bu bölgedeki mutasyonlar değişik metodlar ile analiz edilebilir bunlar: PCR ürünlerinin agaroz veya poliakrilamid jel ile analizi, PCR/RFLP, SSCP, ARMS, DNA dizi analizi, microarray analizi vb. PCR tekniği moleküler araştırmalarda bir ön işlem olarak uygulanmaktadır.

PCR’nin Kullanım Alanları

• Onkogenez araştırmaları
• Prob oluşturulması
• Klonlama
• Gen ekspresyon araştırmaları
• DNA dizi analizinde
• Büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulması
• Bilinmeyen dizilerin tayini
• RFLP (restriction fragment length polymorphism) analizi
• Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı (mutasyon analizi)
• Prenatal tanı
• Adli tıp (DNA parmak izi araştırması vb.)
• Tarihsel değeri olan DNA’nın incelenmesi
• İn vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede preimplantasyon tanı

Kesim Fragmentleri Uzunluk Polimorfizmleri

DNA kesim enzimleri belli dizilimleri özgül olarak tanır ve keser. DNA’da ortaya çıkan dizilim değişimleri belli kesim enzimlerine ait yeni kesim bölgeleri ortaya çıkarır ya da daha önceden var olan kesim bölgeleri kaybolur. Araştırılan DNA belli enzimlerle kesilip jelde yürütüldükten sonra referans DNA’ya göre değerlendirilir. Elde edilen farklı fragman uzunlukları bize bilgi verir. Belirli kesim enzimlerinin kesme noktalarında ortaya çıkan değişimlerden oluşan RFLP’ler tek nükleotid polimorfizmi SNP olarak bilinir. RFLP analizi mutasyonların ve polimorfizmlerin araştırılmasında, genom haritalamasında kullanılan bir yöntemdir.

ARMS

PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) tabanlı bir mutasyon tarama yöntemidir. Dizilimi ve mutasyonu bilinen bir gen bölgesinin üç farklı primer ile amplifiye edildikten sonra elde edilen ürünler jel elektroforezinde kontrol edilir.

Mikroarray Tekniği

DNA mikroarray; tek bir çip üzerinde tüm genomun DNA ve ekspresyon ürünlerinin incelenmesi yöntemidir. Yöntem işaretlenerek sabitlenmiş tek zincir DNA molekülleri ile çalışmaktadır. Moleküler biyolojik ve robotik tekniklerin bir arada kullanımı sonucunda, cam matriks üzerinde her biri spesifik bir geni temsil eden sentetik oligonükleotidler, cDNA’lar, BAC, PAC ve kozmitler, PCR ürünleri gibi binlerce DNA parçasının yapıştırılarak dizilmesi ile elde edilen çipler farklı renkte florokromlarla işaretlenmiş test ve referans DNA örnekleri içeren hibridizasyon solüsyonu ile hibridize edilir. Hibridizasyon sonrası florokromların tarayıcıdan elde edilen görüntüsü bilgisayar ortamına aktarılarak çeşitli biyoinformatik analiz programları ile değerlendirilir.

Mikroarray Tekniğinin Kullanım Alanları

• Kanser araştırmaları
• Gen ekspresyon seviyelerindeki değişikliklerin belirlenmesi
• Normal ve patolojik durumlarda gen ekspresyon farklılıklarının incelenmesi
• DNA’daki mutasyon ve polimorfizmlerin (SNP analizleri) tespiti
• İlaç geliştirme çalışmaları
• Genomik kazanım ve kayıpların belirlenmesi
• Gen haritalaması çalışmaları
• Epigenetik modifikasyonlara yönelik çalışmalardır.

Kaynak ve İleri Okuma

1. Çınar Kuşkucu A. Fetal Kromozom Anomalisi Tarama Testleri. JOPP Dergi 2010; 2(2):55–60.
2. Zamani AG. Genetik tanı yöntemleri. Türk Toraks Derneği 10.Yıllık Kongresi, Kurs kitabı, Antalya 2007:143–161.
3. Yrd. Doç. Dr. Ayşe Gül ZAMANİ ; ‘’Genetik Tanı Yöntemleri ‘’ Türk Toraks Derneği Okulu
4. Bozkurt G, Tabakçıoğlu K.’’ Psikiyatrik genetik araştırmalarda kullanılabilecek genetik yöntemler:III. Psikiyatri ve sitogenetik’’ 3P Dergisi 2004;12:20-30.
5. https://dergipark.org.tr/tr/