BilimGenelMakalelerTeknoloji

Kapiler Elektroforez: Sanger Dizileme

Google News Abone Ol

Proteinler, peptidler, amino asitler, nükleik asitler, inorganik iyonlar, organik bazlar, ve organik asitlerin ayırımını oldukça iyi yapar. Hızlı  ve verimli ayırma sağlaması az miktarda numune miktarının yeterli olması ayrıca yüksek selektivite, otomosyon, miktar tayini, tekrarlanabilirlik ve mass spektrometresiyle birlikte beraber kullanılabilir. Cihaz temel boyutta ele alınırsa elektroforez ile kromotografinin bileşimi olan bir tekniktir. Elektroforetik hareket kabiliyeti, faz ayırımı moleküler boyuttaki farklılıklara ve ya bunların bir kaçına bağlı olarak elektroforetik ayırım yapan bir tekniktir. Bu tekniğin önemli bir yanı ise ayrıca nörokimyasal analiz ve DNA dizilemeside yapabilmesidir. Kromatografik yöntemlerle kıyaslandığında nispeten daha yenidir. Ayrıca kısa analiz süresi ile kolay ve rahatlıkla gerçekleştirilebilir. Bu teknik 1960’lı yılların sonunda geliştirilmiş bir tekniktir.

Kapiler Elektroforez Nedir?

Bu teknik kromatografik yöntemlerle kıyaslandığında nispeten daha yenidir. Gıda araştırmalarında nispeten daha iyidir. Temelde ele alırsak özünde boru içerisinde gerçekleştirilen elektroforezdir. Elektroforez, bir elektrik alandaki iyonların mobilitesine dayanan bir ayırma tekniğidir. Bir kompenentin hızı, büyüklüğüne bağlıdır. CE  yüklü taneciklerin elektirik alanda farklı hızlarda hareket etmelerinden yararlanılarak ayrılmasına yarayan bir metottur. Teknik yapısını ele alırsak bir yüksek voltaj güç desteği, bir erimiş silika kapiller, ikim tampon rezarvuarı, iki elektrot ve bir dedektörden oluşur. Ayrıca bu alete otomatik numune verici, enjeksiyon apereyi, dedektör çeşitleri ve ısı kontrolü sağlayıcı bölümler ilave edilebilmektedir.

Temelde ele alırsak elektroforetik hareket kabiliyeti faz ayırımı ve moleküler boyuttaki farklılıklara yada bunların bir kaçına bağlı olarak elektrokinetik ayrım yapabilen bir tekniktir. Gen teknolojisi içinde uygun ve önemli bir tekniktir. DNA dizileme ve fragment analizi için kullanılan kapiler elektroforez cihazı, bir DNA parçacığının baz dizisinin belirlenmesi konusunda standart ve önemlidir.

Kapiler Elektroforez Yöntemleri

  • Kapiler zon elektoroforez (CZE)
  • Miseller elektrokinetik kapiler kromatografi (MEKC)
  • Kapiler jel elektoroforez (CGE)
  • Kapiler izotakoforez (CITP)
  • Kapiler izoelektrik odaklama (CIEF)

Kapiler Elektroforez Çalışma Prensibi

Bir kapiler boru belli PH’da iletken bir sıvı ile doldurulur.  Örneğin ayrılacağı tampon çözeltidir. Kapilere enjeksiyonla uygulanır. Kapiler üzerinde yüksek bir voltaj meydana getirir. Yüksek bir voltaj meydana getirir. Bu sebepten dolayı numune bileşenleri kapiller boyunca farklı hızlarda hareket eder. Pozitif bileşenler negatif  elektroda, negatif bileşenler pozitif elektroda göç ederler.  Bu cihaza belirli bir yerden bakıldığında daha hızlı olan bileşenlerin, sonra ise yavaş bileşenlerin geçtiği görülür. Kapiler elektroforezde ise ayrıcı güç, iyon büyüklüğüne karşı yüklerin oranıdır. Akışla  ayırma değil elektrik alan ile sağlanır. Küçük çaplı kapilerlerde yaspılması, yüksek elektrik alanlarının kullanımına olanak sağlar. Bu ayırma şekli  etkin bir ayırma ve ayırma süresinin kısalmasını  sağlar.

Kapiler Elektroforez Avantajları

  • Hızlı ve verimli ayırma sağlaması
  • Küçük numune miktarının yeterli olması
  • Yüksek selektivite
  • Miktar tayini
  • Tekrarlanabilirlik ve mass spektrometresiyle beraber kullanılır

Sanger Sekanslama

Dideoksi zincir sonlanması olarak bilinen Sanger sekanslama, gen dizileme yöntemlerinden öncüsüdür. Moleküler tanı ve gen üzerindeki varyantların belirlenmesi amacıyla kullanılan bu yöntem, 3′-OH ucu kopartılan ve dideoksi nükleotitler olarak adlandırılan ddNTP’ler ile DNA’da replike olan dizinin sonlandırılmasıdır. Aslında yöntemin temel prensibi DNA zinciri üzerindeki belirli bir noktanın nükleotid dizisini belirlemektir. Sangerin yönteminin ana prensibi zincir sonlandırıcı nükleotit olarak ddNTP’lerin kullanılmasıdır. DNA dizi analizinin işlem hacmindeki önemli artış kapiler elektroforezine dayalı ayırım yönteminin jel tabanlı sistemlerin yerine kullanılmaya başlanması sonucunda yaşanmıştır. Kapiler elektroforeze dayalı ayırım yönteminin yerini almasıyla başlamıştır. Kapiler elektroforezine dayalı DNA analizi yöntemi halen günümüzde hızla gelişmektedir. Genomik ve proteomik alanlarına ışık tutar.

Sanger sıralama yapmak için PCR ilgi bölgenizi yükseltmek ve daha sonra ilk etapta özel bir polimeraz ve serbest nükleik asitlerin iki  tür ile karışık parça yükseltmek için kullanılan astarbiri ile reaksiyon koymaktır. dNTP’ ler  3′ ucuna ek nükleotitler eklenebilen ATGC’ler dir. DNA dizilimi için sanger yöntemi A astarı bir diziye annealed, reaktifler, DNA polimeraz dNTPs floro gözenekleri etiketlenmiş ddNTPs küçük bir miktar da dahil olmak üzere astar ve şablon eklenir. Astar uzaması sırasında DNA polimeraz eksik hidroksil ile reaksiyona giremediği için dNTP yerine bir ddNTP’nin rasgele takılması zincirin sentezini sonlandırır. Zincirin tüm olası uzunluklarını üretir. Ürünler tek şeritli kılcal jel üzerinde ayrılır. Ortaya çıkan bantlar bir görüntüleme sistemi tarafından okunur. Bir kaç bin yüz nükleotit bir gün, depolama için veri üretir.

Aynur Atan

Nevşehir Hacı Bektaşi Veli Üniversitesi Moleküller Biyoloji Genetik

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir