Canlılar, sahip oldukları aminoasitleri belli bir düzen içerisinde bir araya getirerek proteinleri oluşturur. Bu düzen, genetik materyallimiz olan DNA’nın içerisinde histon proteinlerine paketlenmiş halde muhafaza edinmektedir. Gerektiğinde çözülerek kendini replike eden DNA’nın belli bölümleri, transkripsiyon denilen aşama ile mRNA sentezi gerçekleştirir ve bu bilgiler hücre içerisindeki ribozom organellerine aktarılır. Ribozom da bu bilgiler eşiğinde protein sentezini gerçekleştirebilir.
Günümüzde yaygın bir çalışma alanı olan transkriptom analizi ile stres ortamı gibi özel koşulların, protein sentezi için ne kadar etkili olduğunu veya hangi proteinlerin ekspresyonunu etkilediğini öğrenebiliriz. Ancak bu analizden önce genellikle çalışma yapılacak olan örneklerde ilgili proteini kodlayan ekzonik bölgelerde mRNA sentezini etkileyebilecek ölçüde mutasyon olup olmadığına bakılması önerilir. Böylece transkripsiyon mekanizmasının ekzon bölgelerinde sorun olmasından mı yoksa stres koşulundan mı kaynaklandığı yönünde daha doğru bir sonuca varılabilir.
Transkriptom RNA Dizileme Aşamaları
Transkriptom RNA analizi için dikkat edilmesi gereken bazı aşamalar vardır. Özellikle analiz için hangi seçeneği kullanacağınıza karar vermek önemli bir başlangıçtır. Eğer kısa ve düşük miktarda mRNA inceleyecekseniz, RT-PCR yöntemini kullanmayı düşünebilirsiniz. Ancak tüm mRNA’lara bakmayı düşünüyorsanız, yeni nesil dizileme yöntemlerini kullanmanız gerekebilir. Biz bu makalede yeni nesil dizileme yöntemleri ile nasıl transkriptom RNA dizileme yapılabileceğini inceleyeceğiz.
RNA İzolasyonu
Çalışılacak olan canlıdan total RNA izolasyonu yapılmalıdır. Ardından bu RNA molekülerinden çalışılmak istenen RNA moleküllerini izole etmek için RNA deplesyon yöntemleri kullanılabilir.
RNA Deplesyonu
Bazı durumlarda boyuta göre seçim yapmak yardımcı olabilir. Bunun için jel elektroforezi yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Örneğin bu yol ile small RNA dizileme yapılacak ise sadece ufak RNA moleküleri izole edilebilir veya diğer uzun RNA molekülleri izole edilerek farklı bir çalışma yapılabilir.
Kütüphane Aşaması
NGS platformları genel olarak adaptör ve barkod dizilerin eklenmesini temel alan kütüphane aşamasını içerir. Ancak yeni nesil dizileme sistemleri, kendine has yöntemleriyle ara basamakları da içerebilir. Örneğin DNBseq platformu için DNA nanoball oluşturulmalıdır. illumina sisteminde ise köprü amplifikasyonu için barkod diziler eklenmelidir.
Sekans Aşaması
NGS platformlarının çoğu çip sistemleri ile çalışır ve örnek bu çipe yüklendikten sonra amplifikasyon ile sekans çıkarılır. Her baz eklenmesi ile cihaz bu ara reaksiyonu kaydeder ve data oluşturur. Oluşan bu veriler biyoenformatik analiz aşamasında birleştirilir ve referans canlı genomuna hizalanır.
Biyoenformatik Analiz
Biyoenformatik analiz aşamasına gelindiğinde, sekans aşamasında oluşan veri, referans canlı genomuna hizalanarak karşılaştırılır ve olası SNP’ler, yolak analizleri, yeni transkript tespiti gibi farklı analizler sonuç olarak raporlanır. Bu veriler, canlının daha önceki veri havuzunun derinliğine göre farklı ölçülerde analiz edilebilir.
Faydalı bir makale olmuş. Baştan sona okudum.