Çevrede bulunabilen organizmaların kalıntılarından elde edilen DNA’dır. Çeresel DNA, organizmalar tarafından( cilt, dışkı vb yoluyla) saçılan veya dökülen hücresel materyalden, yeni moleküler teknikler kullanılarak örneklenebilen ve izlenilebilen sucul ve karasal ortamlardan kaynaklanır. Bu teknik, istilacı türlerin erken tespiti ve nadir şifreli türlerin tespiti için önemlidir. Temel olarak ele alırsak nükleer veya mitokodriyal DNA numuneleridir. Deniz suyu, kar suyu, hava veya canlının yaşadığı ortamdan örnekler toplanabilir. Kaynakları canlının dışkısı, mukoza, gamet, dökülmüş deri ve saç parçaları içerebilir. Bu türler ve çevre ile etkileşime girdikçe ortama DNA bırakırlar. Bu DNA çeşidi biyoçeşitliliğin izlenmesi açısından çok önemlidir. Spesifik bir araştırmada canlı çevresi hakkında bilgi sunar. Ayrıca tür korunması için çok önemlidir. Nedeni ise canlıyı strese sokmadan biyo-izlemeye izin verir.
Çevresel DNA’nın Kökenleri
Canlı organizmaların boyutlarına ve ekolojilerine bakılmaksızın, çevrelerinde şu anki veya geçmiş varlıklarını yansıtan DNA parmak izlerini bırakır. Çevreye salınma şekilleri dışkı, idrar, gamet, mukus bunlara benzer yollarla dağılabilir. Ölü olan organizmaların ayrışmasından da kaynaklanabilir. Çevresel DNA, nükleer, mitokondriyal, veya kloroplast DNA’nın karmaşık bir kombinasyonu ile karakterize edilir. Canlı hücrelerden veya hücre dışı olabilir. Bu örnekler yüksek verimli DNA sekanslama ile analiz edilir. Biyoçeşitliliğin hızlı ölçümü ve izlenmesi için metagenomik, metakar kodlama ve tek tür tespiti olarak bilinen tekniklerdir. Metakar kodlama bu teknik için kilit görev oynar, nedeni ise DNA barkodlama ile tür tespiti yapıldığı içindir. Barkodlama kullanılarak farklı türden organizmaların topluluklarını tanımlamak için farklı gen lokusları kullanılır. Mikroorganizmalar farklı gen lokusları kullanılarak saptanır. Önceden çalışılmış bir DNA havuzu ( kütüphanesi ) kullanılır. Örnekler, Blast yoluyla bu önceden çalışılmış kütüphane kullanılarak hangi organizmaları barındırdığını belirlenir.
eDNA’nın gelecekteki çevresel izlemede önemli bir rol oynaması beklenmektedir. eDNA, ekolji, biyoloji ve agronomi ile birleştiğinde moleküler biyoloji, populasyon genetiği ve biyoinformatik becerilerine dayanmaktadır. DNA ve RNA dizileme teknikleri alanındaki hızlı gelişmeler, izleme ve araştırma uygulamaları için eDNA’ya dayalı tekniklerin yaygın olarak kullanılması olan ilgiyi arttırmıştır.
Çevresel DNA Analizi Nasıl Yapılır?
- Örnek koleksiyon
- DNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
- qPCR testi
eDNA’nın incelenmesi qPCR ile birey popülasyon, tür, cins, veya aile düzeyinde metabarkodlama yoluyla veya ekosistem karakterizasyonunun belirlenmesi için mevcut alandan toplanan DNA’ya denir. Örnekler su toprak, tortu, yüzey bezleri, dışkı şeklinde toplanır. Tekniğin hitap ettiği kesim bakteri, amfibiler, balıklar, kabuklular, bitkiler, DNA’yı amplifiye evrensel primerleri veya veri olarak toplam çevresel DNA’yı kullanır. Örnekler toplandıktan sonra DNA toprak ve tortu içinde fazlaca bulunan ve PCR reaksiyonunu güçlüce inhibe eden hümik asit gibi kimyasalları uzaklaştırmak için ortaya çıkarılmalı ve daha sonra saflaştırılma işlemi yapılmalıdır. Son aşama olarak ise qPCR yoluyla, olağan bir eDNA hedefinin seçilmesine dayanır. İdeal eDNA, qPCR hedefe türe özgü olarak spesifik şekilde bulunur. Mitokondriyal DNA (mtDNA) her iki kutuyu da kontrol ettiği için popüler bir hedeftir. Bu DNA’nın özelliği türler arasında önemli farklılıklar gösterir. Hücre başına yüzlerce kopya mtDNA vardır. Belirlenen bölge veya sekans gerçek zamanlı PCR ile tespit edilir. İşlem belirlenen hedef dizinin binlerce kopyası şablon DNA’dan (saflaştırılmış eDNA örneği ) ve ileri ki işlem ise floresan sinyal ampflikasyonu yoluyla gerçek zamanlı olarak tespit edilir. İşlem sonucunda optik okuyucuların sinyalinde yükselme tespit edilirse işlem pozitif olarak kabul görür.
Çevresel DNA Dizileme Yöntemleri
eDNA Metabarcoding
- Kısa DNA fragmanlarını güçlendirmelidir.
- Farklı taksonomik topluluklar için uyarlanmalıdır.
- Çok yönlü olmalıdır.
- Çok iyi bir taksonomik çözünürlüğe sahip olmalıdır.
Biyolojik çeşitliliği değerlendirmek için yeni bir tekniktir. Burada ki numuneler, DNA’nın çıkarıldığı su hava tortu veya hava yoluyla ortamdan alınır. Daha sonra polimeraz zincir reaksiyonda genel veya evrensel primerler kullanılarak amplifiye edilir. Yeni nesil sekanslama kullanılarak binlerce milyonlarca okuma oluşturmak içindir. Verilerden türlerin varlığı belirlenebilir. Genel biyoçeşitlilik değerlendirelebilir. Geleneksel alan tabanlı ekolojiyi bir araya getiren gelişmiş bir yöntemdir.
Organizmaların kendine özgü bir DNA dizisi veya barkodu vardır. DNA barkodu, korunmuş genomik bölgeler arasına serpiştirilmiş oldukça değişken bir bölgedir. eDNA metabarkodu, genellikle CO1 veya 18S ribozomal alt birim olmak üzere bu barkodların hedefe özgü amplifikasyonu ve sekanslamasını içerir. Bunlar üst düzey ökaryotları ayırt etmek için önemlidir.
16S\18S\ITS Metagenom Sequencing
rRNA geni, bakteri ve arkea cins ve türlerin tanımlanması ve taksonomik önemi için fazlaca kullanılan gen işaretleyicisidir. Ayrıca 18S rRNA filogenetik için mantarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. 16S’ten daha fazla hiperdeğişken alanlara sahiptir. Nükleer rRNA istronunun posttranskripsiyonel işleminde çıkarılan ITS (Dahili Transkripsiyonlu Spacer), en geniş mantar bölgesi dahil başarılı bir mantar tanımlama için, genel olarak evrensel olarak bir mantar barkod işaretleyicisi olarak kabul edilir. 18S ile karşılaştırılma yapıldığında ise ITS, intraspesifik genetik çeşitliliği ölçmek için genetik belirteç olarak değişken bir yapıya sahiptir. Dolayısıyla daha uygun bir potansiyele sahiptir. Korunmuş olan genlerin hiperdeğişken bölgeleri veya 16S bakteri veya arkea veya 18S\ITS mantar gibi intergenik bölgeler PCR ile çoğaltılır. Ardından yeni nesil sekanslama teknolojisi (NGS) kullanılarak analiz edilir. Çalışma sonucunda elde edilen diziler mikrobiyal veritabanlarıyla karşılaştırılır. Tek bir türün tanımlanmasından, hayvanların ve bitkilerin karakterize edilmesinden çeşitli çevresel kaynaklardan veya coğrafi bölgelerin tür çeşitliliğin ve nüfus yapısının karşılaştırılmasına kadar bir çok geniş yelpazede analiz imkanı sunar.
Environmental Shotgun Sequencing
Çevresel DNA’nın av tüfeği dizilimi bakteri veya küçük ökaryotlar gibi çok fazla miktarda bulunan türlerin incelenmesi için yapılır. Topluluk biyoçeşitliliğine ilişkin yeni bir sıralama yaklaşımıdır. Geniş mikrobiyal toplulukların tespiti ve analizi için kullanılır. Bu teknik bir topluluktaki tüm hücrelerden DNA ekstraksiyonu ile başlar. Sekanslama hedefi olarak belirli bir genetik lokus kullanılmasını önler. Özgür olarak dizilenen fragmanlar, örnekteki çok sayıda genom için lokuslara hizalanır. Mikrop olmayanları içerir. Böylece amplikon sekanslamada mevcut virüs zayıflığının üstesinden gelir. Hizalanmış sekanslar, 16S rRNA sekansı gibi taksonomik olarak bilgi verici sekanslardan olabilir. Diğer bir taraftan biyolojik olarak bilgi verici olabilir.
Uzun Menzilli PCR
İsminde de belirtildiği gibi uzun aralıklı PCR, mitokondriyal genomlar gibi büyük DNA sekanslarını amplifiye etmek için kullanılır. Daha uzun DNA dizileri, daha küçük DNA barkodları olmadığında türler arasında farklılığın sağlanmasına yardımcı olur. Bu teknik, çevre tarafından parçalanmamış DNA dizilimi için uygundur. Ayrıca bu teknik NGS platformlarıyla birleştiği zaman az sayıda örnekte bile esnek, hızlı, verimli düşük fiyatlı bir seçimdir. Uzun menzilli PCR tekniğindeki gelişmeler genomik haritalama ve sekanslama PCR’a hız ve basitlik getirdi. Eğer ki sekanslama ile birleştirilirse uzun menzilli PCR daha fazla hassasiyet imkanı sunar. Genetik varyasyonları tespit etmek içinde daha hızlı ve düşük maliyetli bir olanak sağlar.
Çevresel DNA Yaklaşımlarının Sınırları
Bu uygulamanın bir çok avantajı olmasına rağmen eDNA ile çalışırken bir kaç önemli parametre vardır. Farklı organizmalar veya belirli canlılar farklı yaşam evrelerinde DNA’yı farklı oranda dökerler. Ayrıca DNA bozulma hızı büyük oranda sıcaklık ve mikrobiyal aktivite çevresel etkenlere bağlıdır. Bu etkenlerin dezavantajı tür yoğunluğunun ve bir türün çevrede ne kadar zaman önce mevcut olduğuna dair bilgiyi ulaşmayı sınırlandırır. Diğer bir hususta, bozulma oranını etkileyen çevreye özgü faktörlerin dikkatle araştırılması ve DNA dökülme oranını ölçmek için laboratuvar tabanlı çalışmalar uygulanabilir.
WCS eDNA’yı nadir bir kaplumbağa türü olan Rafetus swinhoei’yi kullandı. Nasıl bir yol izledikleri aşağıda ki video da anlatılmıştır.
