RNA İzolasyonu Nasıl Yapılır?

Kelime anlamı olarak ayrılma ve yalıtım anlamına gelen izolasyon kelimesinin biyolojik anlamı ise benzer bir anlam taşımakta. Genellikle deneylerde kullanıyor olduğumuz bu terim DNA/RNA gibi moleküllerin diğer bileşenlerden ayrılarak saflaştırılmasıdır. Burada yapılan bu saflaştırma işlemleri sonucu elde dilen DNA/RNA molekülleri gerekli çalışmalar için hazırlanmaktadır. Bu yazımızda sizlere RNA izolasyonu hakkında bahsedeceğiz.

RNA, tüm canlı hücrelerde protein sentezinin tüm aşamalarında kullanılmakta ve birçok virüs için genetik bilgi taşımaktadır. RNA’nın moleküler biyoloji deneylerinde çıkarılması, RNA örneklerini bozan her yerde bulunan ve kararlı RNazların varlığı nedeniyle büyük ölçüde karmaşıktır.

RNA İzolasyonu

RNA’nın moleküler biyoloji deneylerinde çıkarılması, RNA örneklerini bozan her yerde bulunan ve kararlı RNazların varlığı nedeniyle büyük ölçüde karmaşıktır. TRIzol Reagent, hücrelerden ve dokulardan RNA izolasyonu için kullanılan kullanıma hazır bir reaktiftir. TRIzol, doku homojenizasyonu sırasında RNA bütünlüğünü korurken hücreleri ve hücre bileşenlerini parçalayarak ve parçalayarak çalışır. Santrifüjlemeden sonra kloroform eklenmesi, çözeltiyi sulu ve organik fazlara ayırır. RNA sadece sulu fazda kalır.

Sulu faz aktarıldıktan sonra RNA, izopropil alkol ile çökeltilerek geri kazanılabilir. Bununla birlikte, DNA ve proteinler, sulu fazın çıkarılmasından sonra sıralı ayırma ile geri kazanılabilir. Etanol ile çökeltme, ara fazdan DNA gerektirir ve izopropil alkol ile ek bir çökeltme, organik fazdan proteinler gerektirir. TRIzol Reaktifi ile ekstrakte edilen toplam RNA, protein ve DNA kontaminasyonu içermez. Bu RNA, Northern blot analizinde, in vitro translasyonda, poli (A) seçiminde, RNaz koruma testinde ve moleküler klonlamada kullanılabilir.

Bazı RNazlar son derece kararlı olabilir ve nötrleştirici DNazlarla karşılaştırıldığında etkisiz hale getirilmeleri zordur. Salınan hücresel RNazlara ek olarak, çevrede bulunan birkaç RNaz vardır. RNazlar, çeşitli organizmalarda birçok hücre dışı fonksiyona sahip olacak şekilde değiştirilir. Bu salgılanan RNazlar için enzimatik aktivite, RNaz’ın ifade edilen fonksiyonu için gerekli olmayabilir. Örneğin, immün RNazlar, bakterilerin hücre zarlarını destabilize ederek etki eder.

Buna karşı koymak için, RNA ekstraksiyonu için kullanılan ekipman genellikle tamamen temizlenir, ortak laboratuvar ekipmanından ayrılır ve RNazları yok eden çeşitli sert kimyasallarla işlenir. Aynı nedenle, test uzmanları çıplak tenlerinin ekipmana temas etmemesine özellikle dikkat ederler.

Kaynak 

1. Plazmid izolasyonunda tercih edilebilecek birçok yöntem vardır. Alkali kırma yöntemi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Stuart N. Peirson, Jason N. Butler, RNA Extraction From Mammalian Tissues, 2007
2. amrita.edu,. (2011). Isolation of RNA. Retrieved 29 December 2020, from vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=186&sim=718&cnt=1
3. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.  Biochem.162, 156–159.