SEO ve Reklam Ajansı
Bilim Ve Tekno

Primer Nasıl Tasarlanır?

Primer Nasıl Tasarlanır?

Primer Nedir?

Primer, DNA’da istenilen bölgeyi “Polymerase Chain Reaction” (PCR) ile çoğaltırken istediğimiz kısmı başlangıç ve istediğimiz kısmı bitiş olarak seçmemize yarayan, reaksiyonun kalitesine önemli ölçüde değer katan bir dizi bazdan oluşmaktadır. Primerin nasıl tasarlandığı Polimeraz Zincir Reaksiyonuna doğrudan etki ettiğinden önemli bir kriterdir.

PCR Nedir?

Hemen hepiniz “Primer Nasıl Tasarlanır?” sorusuna cevap arıyorsanız bu kısmı biliyorsunuz demektir. Ancak yine de bilmeyenlerin olabileceği ihtimalini göz önünde bulundurarak bir açıklama yapalım.
Günümüz Genetik Mühendisliği CRISPR Tekniği” yazımızda PCR’a değinmiştik. İsterseniz o yazımızı da okuyabilirsiniz. PCR, genetik mühendisliğinin temelini oluşturan tekniklerden biridir. Nitekim DNA’nın çalışılmak istenilen bölgesi birazdan nasıl tasarlandığını anlatacağımız primerler ile çoğaltılır ve incelenir veya işlenir.

1985’te Cetus firmasının insan genetiği departmanında araştırmacı olarak çalışan Karry MullisYellow Stone Milli Parkı‘nda yaşayan “Thermus Aquaticus” bakterisinden sıcağa dayanıklı “Taq Polimeraz” enzimini izole ederek, PCR‘ın gelişimine büyük ölçüde katkı sağlamış ve 1993’te kimya nobel ödülüne layık görülmüştür.

İdeal Primer Nasıl Olmalı?

Her şeyin bir kalitesinin olduğu gibi, primerin kalitesi de PCR’ı doğrudan etkilediğinden oldukça önemli bir kriterdir. “İdeal Primer Nasıl Olmalı?” sorusunun cevabı ise bir çok etmene bağlı.

Primer Uzunluğu

Birçok primer tasarımı görmüşsünüzdür. Boyları genelde 18 ile 22 baz, bazense 25’e yakın olmaktadır. Bu miktar tesadüf olarak seçilmez. Primerin boyunun artması, spesifikliğini önemli ölçüde etkiler. Tasarlanan primerin spesifik olması oldukça önemli bir kriterdir. Nitekim spesifik olmaması, istenilen yerin çoğaltılamaması, çoğalan farklı bölgelerin olması veya kontamine olması gibi birçok istenmeyen sonucu ortaya çıkarabilir.

Tepkime Sıcaklığı

Primer tasarımında dikkat edilmesi gerekenler başlığı altında bir başkası da tasarlanan primerin “Guanin” ve “Sitozin” bazlarının içeriğidir. Primerdeki guanin ve sitozin oranının, fazla olması sıcaklığı arttırmaktadır. Bu da “PCR protokolü hazırlama” kısmında zorluklar ortaya çıkarabilir.

Bazlar PCR Protokolüne Nasıl Etki Eder?

Primerde bulunan bazların miktarı, PCR protokolüne sıcaklık miktarı ile etki eder. Bu etki aşağıdaki formül ile özetlenmiştir.

Tepkime Sıcaklığı= 4*( G + C ) + 2*( A + T )

Baz Tekrarları

Aynı bazların üst üste 4-5 kere tekrar etmesi primerin kalitesini önemli ölçüde düşürür. Ayrıca üretilen primerin tekrar eden bazlar ile bitmesi de reaksiyonu büyük ölçüde tehlikeye sokar. Yapışma ve spesifiklik bundan olumsuz yönde etkilenir ve reaksiyon istenilen verimde gerçekleşemez.

PCR Bileşenlerinin Aktivitesi Ve Miktarı

Ortama eklenen PCR bileşenlerinden MgCl DNA polimerazın kofaktörüdür. Ancak ortamda çok fazla bulunduğunda, bu sefer de çift zincir DNA’nın yeterince ayrılamamasına neden oluyor. Özellikle ortamdaki MgCl konsantrasyonu “Temperature Melting” (Erime Sıcaklığı) değerini ciddi ölçüde yükseltebilmektedir.

Primer Spesifikliği

Oluşturulan primer hedef organizmanın genomunda yalnızca bir yere bağlanabilmeli, yani oraya spesifik olmalı. Başka bir yere daha %100 olarak bağlanma potansiyeline sahipse PCR tepkimesi istenilen verimde gerçekleşmez ve kontamine olur.

Primer Nasıl Tasarlanır?

Sekans için güvenilir veri tabanlarından “ENSEMBL” kullanılabilir. Sekans aracı yardımı ile istenilen exon veya birbirine yakın ise exonları çoğaltmak için o bölgeleri içerisine alabilecek yani dışında kalan baz dizileri seçilmelidir. Bu baz dizileri 18-22 nükleotit uzunluğunda olması önerilir.

Seçilen baz dizilerinin istenilen yer dışında başka bir yere bağlanıp bağlanmadığı “BLAST”  ile kontrol edilir. Bağlanıyor ise sekans tekrar incelenir ve aynı özelliğe sahip baz dizisi tekrar aranır. Bu işlem spesifiklik sağlanıncaya kadar tekrar edilir.

Spesifiklik sağlanınca IDTDNA ile uygun PCR protokolü girilerek, TM sıcaklığı hesaplanır. Oluşturulan protokolde MgCl, taq polimeraz ve primer miktarlarına dikkat edilmelidir.

Primer Tasarımı Resimli Anlatım

Primer Nasıl Tasarlanır Primer Nasıl Tasarlanır Primer Nasıl Tasarlanır Primer Nasıl Tasarlanır Primer Nasıl Tasarlanır Primer Nasıl Tasarlanır

 

 

ZİYARETÇİ YORUMLARI

Henüz yorum yapılmamış. İlk yorumu aşağıdaki form aracılığıyla siz yapabilirsiniz.

BİR YORUM YAZ