MLPA Yöntemi Nedir? Nasıl Yapılır?

MLPA, yani Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplication (Çoklu Ligasyona Bağlı Prob Amplifikasyonu) tek bir nükleotid değişikliği olan dizilerde dahi ayrımını sağlayacak şekilde 50 kadar genomik DNA veya RNA dizisindeki “Normal Olmayan Kopya Sayısı”nın tespitini sağlayan bir “Multiplex” PCR yöntemidir. 

İlk kez 2002 yılında kullanılmıştır. Bugüne kadar 750 den fazla makale MLPA yöntemi kullanılarak yazılmıştır. Her yıl 1.000.000 kadar çalıma, MLPA yöntemi kullanılarak yapılmaktadır. Dünya genelinde 80 ülkede 800’den fazla laboratuvarda rutin olarak kullanılmaktadır. MLPA çalışması için sadece bir thermal cycler ve kapiler elektroforez cihazı yeterlidir. Aynı anda 96 kadar numuneyi, 24 saat içinde sonuç alacak şekilde tabi tutmak mümkündür.

MLPA, kopya sayısı belirlenmesi konusunda diğer tekniklere karşın daha hassastır. İyi karakterize edilmiş delesyon ve amplufikasyonlar PCR ile belirlenebilsede, çoğunlukla delesyonrın tam kırılma noktaları bilinememektedir. FISH yöntemi ile tespiti mümkün olmayan sık tek gen değişikliklerinin 50-70 nükleotid gibi kısa dizilerin belirlenmesinde oldukça avantaj sağlamakta ve bu yüzden oldukça fazla tercih edilmekte ve kullanılmaktadır. 45 farklı dizilimi hedefleyen MLPA reaksiyonu için sadece 20 nanogram DNA yeterlidir.

MLPA Yöntemi Aşamaları 

1. DNA denatüre edilir.
2. MLPA prob karışım ile bir gün inkübasyon yapılır.
3. İki prob komşu dizilere tamamen hibridize olur.
4. Ligasyon aşamasında sadece komşu hedeflere hibridize olmuş iki probun bağlanması gerçekleşir.
5. PCR reaksiyonu sırasında sadece bağlı problar çoğaldığından, prob bağlı ürünün sayısı örnekteki hedef dizi sayısı için ölçü teşkil eder.
6. Kapiler elektroforez kullanılarak çoğaltılan ürünler ayrıştırılır.
7. Bağlanmamış prob oligonükleotidler, bir primer dizisi içerirler.
8. Sonuç olarak bunlar eksponansiyel olarak çoğaltılmaz ve bir işaret de üretmezler.
9. MLPA yönteminde bu yüzden, bağlanmamış probların bertarafı gereksizdir ve bu da yöntemin uygulanmasını kolaylaştırır.

MLPA Reaksiyonu

MLPA reaksiyonu, 5 safhada incelenebilir.

1. DNA denatüre edilir. (98°C’de 5 dakika)
2. MLPA problarının hibridizasyonu (95°C’de 1 dakika inkübe ve 16 saat 60°C’de inkübasyon)
3. Ligasyon (bağlanma) reaksiyonu
4. PCR reaksiyonu (Primer+dNTP+polimeraz)
5. Amplifiye ürünün elektroforez ile ayrıştırılması
6. Veri analizi (dNTP’lerin yaptığı ışımalar florometre ile ölçülerek oluşan piklere göre analiz yapılır.)

MLPA Kullanım Alanları

• Mutasyon analizleri
• Tek nükleotid polimorfizmi
• DNA metilasyon analizi
• mRNA konsantrasyonu
• Hücre hatlarının ve dokularının kromozom analizleri
• Gen kopya sayısının analizleri
• Kanser genlerindeki duplikasyon ve delesyonların tespiti
• Anöploidi tespiti
• Prenetal teşhis vb.