CIDER Sekanslama

Stephen Hawking’in bir sözüyle başlamak istiyorum:

“Bilim, sadece bir akıl yöneticisi değildir, aynı zamanda romantizm ve tutkudur.”

Bir bilim insanı da bilimin ışığında tüm tutkusuyla yeni ışıkların arayışına gider. Bulduğu ipucu ve açtığı her gizemli kapı bilim insanını daha farklı serüvenlere yelken açmasını sağlar. Şimdi bu serüvenlere kapılıp giden bir grup bilim insanın geliştirdikleri sekanslama yönteminden bahsedeceğim.

Bakteriyel plazmitler ve genomları, Ökaryotik organellerin (Mitokondri ve Kloroplast) genomları, bazı virüs ailelerinin genomları ve son zamanlarda keşfedilmiş olan eccDNA (Ekstrakromozomal dairesel DNA) molekülleri, doğada dairesel DNA molekülleri halinde bulunmaktadır.Bu dairesel DNA moleküllerinin yüksek verimli yöntemlerin kullanılmasıyla bile %100 uzunlukta sekans eldesi sağlanamamaktadır. Bu yöntemlerden biri dairesel DNA’nın izole edilmesiyle başlamaktadır. İzole edilen dairesel DNA daha sonrasında restrüksiyon enzimiyle kesilerek kısa doğrusal DNA parçalarına dönüştürülür. Bu parçaları, Agaroz Jel Elektroforezi işlemlerinden geçerek izole edilip klon kitaplığı oluşturulur. Bu işlem sonrasında bilgisayar ortamında hesaplamalar yapılarak bir sekans elde edilir.

Devang Metha ve çalışma arkadaşları, PCR ve restriksiyon enzimleri kullanmadan dairesel DNA’yı izole etmeyi ve aynı zamanda dairesel DNA’yı sekanslamayı sağladıkları bir yöntem geliştirmişlerdir. Bu yönteme ise CIDER -seq yani dairesel DNA zenginleştirme sekansı adını  vermişlerdir ve bu sekanslamayı ilk olarak Arabidopsis thaliana bitkisinden karşıladıkları eccDNA üzerinden sağlamışlardır.

CIDER Sekanslamanın Diğer NGS’ler ile Karşılaştırılması

CIDER sekanslama, eccDNA’larda tekrarlanmış dizilerini ve eccDNA’ların hangi organizmadan geldiğini dahil  eccDNA’ların ful sekanslarını elde etme özelliklerine sahiptir. eccDNA profillemesi için kullanılan ve aynı zamanda kısa- okuma Illumina sekanslama olan diğer metotlar Circulome-seq ve Mobilome-seq’tir. Mobilosome sekanslama, dairesel DNA’yı zenginleştirmek adına Phi29 DNA Polimeraz enzimini kullanmaktadır. Circulome sekanslama ise daha kompleks bir protokol kullanır ve Sezyum klorür yoğunluk katman seperasyonu ve ekzonükleaz muamelesi ile dairesel DNA’nın izole edilmesini kapsamaktadır. CIDER-seq yöntemi ile karşılaştırıldığında, bu metotlar tek-molekül sekans verileri üretememektedirler ve bağlantı-etiketleme yaklaşımlarının (enzimle kesilen DNA parçalarının gen sıralamalarına göre birleştirilmesi) dezavantajlarını paylaşmaktadırlar.  Circulome-seq ve CIDER-seq karşılaştırıldığında ise Circulome sekanslamanın eccDNA moleküllerini daha yüksek sekanslama bölgesine sahip olsa da uygulanan protokolün CIDER sekanslamaya göre daha komplike bir protokole sahip olduğunu belirlemişlerdir.

CIDER Sekanslamanın Basamakları

Total DNA Ekstraksiyonu

Yüksek kalite total DNA eldesinin hazırlanması için ilgilenilen tür için en uygun protokolün seçilmesi gereklidir. Degrede olmuş DNA’nın genişletilmesi, Agaroz  Jel Elektroforezi veya Biyoanalyzer kullanımıyla saplanabilir. Metha ve çalışma arkadaşları, eccDNA eldesini Arabidopsis thaliana bitkisinden karşılamışlardır.

Dairesel DNA Amplifikasyonu

Dairesel DNA  zenginleştirme işlemi isteğe bağlı olarak bir boyut seçme adımıyla başlar. Ardından rastgele primerlerin kullanımıyla denatüre edici olmayan Phi29,  dairesel DNA’nın rolling-circle amplifikasyonunu (RCA: yuvarlanma dairesi amplifikasyonu) gerçekleştirerek dairesel DNA kalıbı içinde çoklu dallanmalar meydana getirir.

Dairesel DNA Amplifikasyonu için

1. Phi29 DNA Polimeraz enzimi,
2. Phi29 tamponu,
3. Exo-resistant random primer (dışa dayanıklı rastgele primer),
4. İnorganik Pirofosfataz enzimi,
5. dNTP’ler,
6. Nükleaz içermeyen su ve
7. DNA molekülü ile bir karışım hazırlanır.

Phi29 DNA Polimeraz enzimi,3’→5′ ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. Phi29 tamponu ise Phi29 DNA Polimeraz enzimi için optimal koşulların sağlanması için kullanılmaktadır. İnorganik  pirofosfataz enzimi; DNA, RNA, protein ve polissakkaritler gibi makromoleküllerin sentezinde üretilen PPi’ nin uzaklaştırılmasını sağlayan enzimdir.

Dallanmaların Çıkartılması

Bu işlem iki basamaktan oluşmaktadır:

1. Phi29 DNA Polimeraz enzimi,  tek zincirli dallanmaları eşler.(Debranching reaksiyonları)
2. Dallanmalar, tek zincire spesifik S1 Endonükleaz ile muamele edilerek doğrusallaştırılır ve  son olarak T4 DNA polimeraz ve DNA Polimeraz 1 tarafından uzaklaştırılır.

Burada T4 DNA Polimeraz,  dallanmaların kesim işleminin sonlanması için kullanılırken DNA Polimeraz 1 enzimi dairesel DNA içerisinde kalan kesik bölgelerin 5’→3′ ekzonükleaz aktivitesiyle  doldurulmasını sağlamaktadır.

Dallanmaların çıkartılması sonucu ortamda bulunan ve artta kalan primerlerin, dNTP’lerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanılır.

SMRT Kütüphanesinin Hazırlanması ve Barkodlama

Araştırmacılar sekans kütüphanesi oluşturmak adına Multiplexed PacBio SMRTbell sekanslama kütüphanesini kullanmıştır. Bu sekans kütüphaneleri standart kitler ve protokollerle  amplifiye edilmiş, doğrusallaştırılmış ve onarılmış dairesel DNA’nın kopyalarıyla sağlanmaktadır.

Sekanslama kütüphanelerin hazırlanması için SMRTbell Barcoded Adapter Complete Prep Kit-96 (Pasific Bioscience tarafından üretilmiştir.) kullanılmıştır. Üretici firmaya göre DNA örnekleri için T4 DNA Polimeraz ve T4 Polinükleotit Kinaz kullanılmalıdır. Barkodlama, her bir DNA örneklerinin birbirleriyle etkileşime girmesinin ve bağlanmasının engellemesi adına oldukça önemlidir. Barkodlanan zenginleştirilmiş DNA fragmentlerinin boyutlandırılması yapılarak fragmentler sıralandırılır.

CIDER-seq Veri Analizi

Boyutlandırılmış fragmentlerin sekanslaması, Pacbio RSII cihazı kullanılarak gerçekleştirilir. Cihaz, DeConcat Sekanslama-dönüştürme algoritması kullanmaktadır. DeConcat algoritması veri analizi sırasıyla şu şekilde gerçekleşir:

1. Sekans tekrarlı olarak 30nt artışla iki parçaya bölünür.(A—B şeklinde olan sekans A—A’ ve B’—B şeklinde parçalanır.
2. a)A—A’ ve B’—B hizalanarak karşılaştırılır. b)A—A’ komplementer (yani A’—A şeklinde) olarak ve B’—B de normal bir şekilde hizalanarak karşılaştırılır.
3.  Skor her hizalama için hesaplanır.
4. Tekrar birinci aşamaya dönerek sekans bir diğer pozisyonda kesilir ve elde edilen en yüksek hesaplamak tutulur.
5. Her hizalama 1 ve 8 arası olası bir durum vermektedir.
6. Elde edilen bu olası sonuçlar için tekrardan birinci aşamaya gidilir ve en yüksek skor alan hizalama seçilir.

CIDER Sekanslamanın Avantajları

1. Tanımlanmış ve tanımlanmamış tüm virüslerin sekansını elde etmek için kullanılabilmesi.
2. Dairesel DNA’nın tüm uzunluğunu hatasız bir şekilde veri olarak sunması.
3.  Korunmuş Restrüksiyon enzim bölgelerine ve PCR primer bağlanma bölgelerine ihtiyaç duymaması.
4. Erişimi kolay olan veritabanları sunması.

Kaynak ve İleri Okuma

• Devang METHA, L. C.-H. (2020). Full-length sequencing of circular DNA viruses and extrachromosomal circular DNA using CIDER-seq. Nature.
• Devang METHA, M. H.-H. (2018). A new full-length circular DNA sequencing method for viral-sized genomes reveals that RNAi transgenic plants provoke a shift in geminivirus populations in the field.